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免疫组化技术的几点体会
 


更新时间:2010-07-28 11:50:37 作者: 广州医学院第二附属医院病理科 缪秋玲


 

近20年来,免疫组织化学技术在病理学诊断领域的研究和应用越来越广泛,甚至已经成为了病理诊断尤其是肿瘤的鉴别诊断中不可缺少的最重要的辅助手段,使病理学诊断达到了一个新的高度,也为检测肿瘤组织的相关抗原以及指导临床治疗和预后提供了重要依据。然而,免疫组化是一种多步骤、多因素决定的科学实验方法,存在很多干扰因素,影响染色结果,甚至可能导致误判或误诊,本文就日常工作中较常遇到的几个问题进行讨论。
    1、 标本的固定
    组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步,是有效防止组织自溶坏死,抗原丢失的开始。离体组织应尽快的进行取材固定,最好20分钟内,因为有些抗原若固定不及时可能就检测不到了。而对于固定液的选择,原则上讲,应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液,但在病理常规工作中很难做到这一点,因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色,而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛进行组织固定,利用其渗透性强,对组织的作用均匀进行固定。组织固定时间最好在6-24小时内,一般组织固定时间不应超过24小时,随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。另外,非中性福尔马林缓冲液、含酸和含汞固定液亦可导致标记失败或减弱。
    2、 蜡块的选择
    正确选择用于免疫组化的蜡块也是确保染色质量的关键因素之一。很多病例的组织蜡块不止一个,不同的蜡块中,组织成分常常并不完全一样,一般选择最具代表肿瘤特异性的蜡块,最好含有内对照。更值得注意的是,所选取的蜡块除了要包含代表肿瘤特异性的组织外,应尽量避免含有出血、坏死和脂肪组织。这些组织内的抗原大多已被破坏或丢失,最终通常呈片状弥漫染色,除影响制片的美观外,容易导致误判或误诊。而且这些组织通常影响切片的质量。另外,最好不要选择冰冻剩余组织或脱钙组织,冰冻或脱钙一般也会影响组织内的抗原。
    3、 修复方法的选择和对比
    抗原修复是指石蜡切片免疫组化染色前用酶、表面活性剂或微波、金属盐等对被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原进行暴露和修复,使抗原性得到一定程度的恢复过程。修复的方法有酶(胰酶、蛋白酶等)消化、加热法(水浴、微波和高压煮沸等)和超声处理等,或者综合利用以上方法。目前最常用的是加热煮沸法,少数用酶消化法。大量实验表明,固定时间越长的标本,所形成的交联就越紧密,抗原就越难以被激活,所需的修复强度也就越强。各种修复方法染色强度的比较为:高压法>水浴法>微波法。在日常工作中,要根据不同抗原的特性选择合适的修复方法。抗原修复液常用的有枸橼酸缓冲液(pH 6.0)、EDTA缓冲液(pH 8.0~9.0)等。修复液的PH值对染色结果也会产生相当大的影响。研究发现在高PH值约pH8.0~9.0时,都有较好的染色结果,所以目前比较推崇的抗原修复液为高PH值的修复液,尤其是对核阳性的抗体。
    4、 确定阳性对照
    免疫组化染色过程比较复杂、影响因素也很多,故应设置阳性对照和阴性对照。尤其是阳性对照尤为重要。阳性对照包括两种,一种为内对照,这是一种比较理想的对照,对照和测试组织都在同一张切片中,都处于相同的实验条件下,结果更可靠也更具有可比性。另一种称为外对照,有时在测试的切片中不存在已知的抗原,如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤,在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原,如果病变出现阳性反应结果,尚能提示是恶黑,但是如果出现阴性结果,就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原,还是技术问题。因此,应另外设立一个已知的阳性对照。另外,比较简单的方法,是采用阑尾作为阳性对照。阑尾包含的组织种类较多,如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。因此,一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。

    必须指出的是,尽管免疫组化的作用越来越重要,免疫组化技术也越来越受到重视,但是免疫组化仍有一定的局限性。 随着日益频繁的应用, 一些最初认为具有器官或组织特异性的抗原都是相对的。 例如上皮性表记CK (角蛋白) 常可在非上皮性肿瘤(血管、平滑肌、横纹肌和肌纤维母细胞等) 中表达, 间叶性标记Vimentin 对软组织肉瘤也并不特异, 很多癌和恶性淋巴瘤也可表达, 故在应用时应全面分析。
    总之,要做出好的免疫组化结果,除了要求病理技术人员掌握丰富的理论知识外,各单位科室之间还应多做技术交流,以进一步提高免疫组化技术水平。
 

 

 

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