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微波改良Masson三色法在博来霉素诱导的大鼠肺纤维化中的应用
 


更新时间:2010-08-07 10:39:18 作者: 林云恩1 许惠娟2 顾莹莹1


1、作者单位:510120 广州医学院第一附属医院
作者简介: 林云恩 (1982—) 男 学士学位 技师 Email:linyunen@126.com;
广州市沿江路151号广州医学院第一附属医院病理科;联系电话:020-83063097 手机:13631319747
2、作者单位:510120 广州呼吸疾病研究所

 

【摘要】 目的 比较微波改良Masson三色法和V.G染色法应用于博来霉素诱导的大鼠肺纤维化标本胶原纤维染色的效果。方法 建立大鼠肺间质纤维化模型,取正常组及模型组左下肺叶标本,行微波改良Masson三色法和V.G染色法,应用Ashcroft方法进行肺间质纤维化评分比较。结果 微波改良Masson三色法和V.G染色法都能显示肺间质胶原纤维,两种方法进行的评分无显著差异。但微波改良Masson三色法可操作性强,细小纤维显示更清晰,可以更早期的提示肺间质纤维组织增生病变。结论 微波改良Masson三色法比V.G染色法可操作性更强,显示细小纤维更清晰,是提示肺间质早期纤维化的优良染色方法。
【关键词】 微波改良Masson三色法;V.G染色法;肺间质纤维化;博来霉素
特发性肺纤维化( idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种原因不明的弥漫性肺疾病。主要表现为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和肺纤维化,最终导致肺脏结构和功能的严重破坏,目前其发病机制尚未完全阐明。研究发现经气管内灌注博莱霉素(bleomycin,BLM)可以造成大鼠肺纤维化,此病理过程与人类特发性肺纤维化的病理过程极其相似,因此,对BLM致大鼠肺纤维化发生不同阶段的肺组织病理改变进行研究,可以探讨肺纤维化在IPF不同阶段的病变程度,从而为临床制定有效的治疗策略提供理论和实验依据[1],病理学研究的重点落在了如何更准确、更早期的显示肺间质的纤维组织增生技术上。在此,本文比较微波改良Masson三色法和V.G染色法在显示大鼠肺纤维化的效果。
1材料与方法
1.1实验动物 健康雄性SD大鼠40只,体重180-220克,由广东省实验动物中心提供, 动物合格证号:SCXK(粤)2008-0002。饲养在广州呼吸疾病研究所无特殊病原(SPF)动物实验室中。
1.2大鼠肺纤维化模型的复制及分组:
采用戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后固定于手术台上,取颈前正中切口,切开皮肤,逐层分离暴露气管后缓慢注入博莱霉素溶液(5 mg/kg),迅速直立并旋转,使药液均匀分布于两肺,缝合创口。将大鼠随机分为2大组:正常组及模型组(分为3小组:A组造模后7天;B组为造模后14天;C组为造模后28天)。两组大鼠气管内注入等体积的生理盐水。次日各组分别予药,各组按预定时间处死。
1.3 标本采集与处理:采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,股动脉放血处死动物。沿气管打开胸腔,暴露肺组织,用止血钳钳夹左主支气管,气管插管,无菌生理盐水灌洗右肺,每次2ml,共3次。切除左肺。左下肺叶用10%中性甲醛固定后脱水、透明、浸蜡、包埋,切片6um厚,每个肺组织连续切片2张,分别进行微波改良Masson三色法和V.G染色法。
1.4 染色方法
1.4.1 微波改良Masson三色染色法[2]:
微波改良Masson三色法:①切片常规脱蜡至水,置于Bouin固定液中,微波低档4min,水洗(直至切片无色,约3min),②Mayer苏木素染核,微波低档5min,流水冲洗3min,③滴加丽春红2R-酸性品红复合液(用前1:1新鲜配制),微波低档4min,快速水洗,④磷钼酸磷钨酸液微波低档2min,倒掉液体,不经水洗,直接加苯胺蓝液微波低档3min,快速水洗,用1%冰醋酸处理3s,⑤直接用无水酒精脱水,苯酚TO液及TO液透明,中性树胶封片。
1.4.2 V.G染色法[3]:
(1)染色步骤: ①切片脱蜡至水; ②用Harris苏木精染20 min; ③自来水洗; ④蒸馏水洗; ⑤1%酸性品红5 ml与苦味酸饱和液95ml混合液,染色5 min; ⑥95%乙醇快速分化30 s; ⑦常规脱水、透明、封固。
1.5 肺间质纤维化评分标准:Ashcroft方法[4]
0 分: 正常
1 分: 肺泡壁或支气管壁轻度增厚
2 分,3分: 肺泡壁或支气管壁中度增厚,但无肺结构损毁
4分,5分: 纤维组织明显增多,伴明显肺结构损害,有纤维组织条索或小的纤维组织团块形成。
6分,7分: 严重肺结构损毁,大片纤维化区域,蜂窝肺。
8分: 满视野纤维组织。

1.6 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件行独立样本的t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 微波改良Masson三色法和V.G染色法都能显示胶原纤维,两种方法肺间质纤维化评分无显著差异(表1),但微波改良Masson三色法评分在模型组第7天和第14天相对V.G染色法较高,主要在于细小纤维的显示良好。微波改良Masson三色法可操作性更强,细小胶原纤维显示更清晰,可以更早期的提示肺间质纤维组织增生病变。
2.2各组大鼠肺组织大体及光镜改变:正常组大鼠双肺呈粉红色,表面光滑,弹性良好,镜下未见或偶见炎症细胞浸润和极少量肺泡壁、支气管壁轻微增厚。模型组第7天大鼠双肺见密集的点状出血,灶性淤斑,肺体积增大,镜下见肺泡壁、支气管壁增厚,肺泡间隔和肺泡腔内重度炎性细胞浸润,病灶内可见肺泡萎缩,微波改良Masson三色法可见少量胶原纤维及细小纤维被染色蓝色,灶性及丝状,V.G染色法显示灶性胶原纤维增生。第14天大鼠双肺灰白色,局部见大小不等结节状改变,可见陈旧性出血点,弹性差,镜下见肺泡壁明显增厚,可见较多的纤维组织增生,部分肺泡结构消失,微波改良Masson三色法及V.G染色法均可见较多量的胶原纤维组织增生。第28天大鼠双肺苍白,体积缩小,硬度增加,表面结节状改变及条索状凹沟,弹性更差,镜下见肺泡结构破坏,肺泡壁显著增厚,纤维组织呈条索样瘢痕改变,斑片状分布,毛细血管腔闭塞,微波改良Masson三色法和V.G染色法显示胶原纤维显著增多,呈片状。
四、 讨论:
胶原纤维主要成分是胶原蛋白,含有碱性氨基酸,能够与酸性染料进行结合反应,胶原纤维染色就是利用两种阴离子(酸性)染料混合一起或先后作用而完成鉴别染色的。Masson三色法和V.G染色法是传统经典的胶原纤维染色方法[5],能同时显示肌纤维、胶原纤维等,组织形态通过着染蓝褐色的细胞核有很好的辨认性。胶原纤维染色在许多疾病的病理诊断、鉴别诊断和研究工作中均具有非常重要的使用价值,在慢性炎症、机化和瘢痕形成等病理过程的发展中可出现胶原纤维增生。早期在HE染色切片中的这些胶原纤维往往和纤维素很难鉴别,可根据需要通过不同的纤维素染色法[6]或胶原纤维染色法证实。近年来临床上多发的肺、心、肝、胰腺、肾等器官纤维化的病理基础就是胶原纤维增多,器官纤维化发病率呈现增高趋势,而晚期逆转尚没有好的办法,因此,很多研究工作者通过观察动物脏器纤维化的不同阶段的病理改变和治疗效果[1,7,8],以期找到更适用于临床出现早期脏器纤维化患者的药物或治疗方案。肺纤维化的病理特征是肺泡上皮的损伤和成纤维细胞增殖,BLM致肺纤维化大鼠其肺部早期以肺泡炎症改变为主,轻微肺泡壁、支气管壁增厚,纤维组织增生;晚期以肺泡壁、支气管壁显著增厚,肺间质纤维化明显。本研究结果显示:微波改良Masson三色法在早期显示肺泡壁、支气管壁轻微增厚,细小纤维组织增生方面有显著的优势。
相对于V.G染色法存在显示纤维对比不鲜明、分化不易掌握、长期存档易褪色等缺点,微波改良Masson三色法融入微波技术,条件稳定,具有可操作性高,蓝色胶原纤维和红色肌纤维对比鲜明,细小胶原纤维显示更清晰等优势,在组织纤维化早期及纤维化治疗效果等方面具有很好的提示作用,不管是临床诊断还是开展科研工作方面,都更值得推广应用,协助临床诊断患者是否存在早期肺纤维化,从而为早期治疗提供依据,避免出现晚期全肺纤维化的不可逆转病变。
 

两种方法肺间质纤维化评分的比较

分组及造模时间

V.G染色法

微波改良Masson三色法

P

正常组

3

4

0.660

模型组A 7

23

29

0.478

模型组B 14

44

46

0.628

模型组C 28

65

66

0.820

两组分别比较,P值均>005

 

参考文献:
1 金晓光,代华平,庞宝森,牛淑洁,李 雪,吕 ?,王 辰 博来霉素致大鼠肺纤维化模型肺组织的动态病理变化及其发生机制 中国病理生理杂志2009, 25(4): 708-714
2 林云恩,许惠娟,何萍,余妙丽,何新明 介绍一种Masson三色的微波改良染色法
3 郑集义VanGieson染色液的配制及染色体会临床与实验病理学杂志2005; 20(4)496-497
4 Ashcroft,T. Simpson,J.M Timberbell,V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J.Clin.Pathol.1988,41,467-470
5 凌启波. 实用病理特殊染色和组化技术.广东高等教育出版社,1989:4-9
6 林云恩,顾莹莹,刘慕嫦,何萍,杨通,冼慧仪,何新明,莫明聪 纤维素染色效果比较 中国热带医学 2008;12 2241-2242
7 A. Fabre, J. Marchal-Somme, S. Marchand-Adam,C. Quesnel, R. Borie, M. Dehoux, C. Ruffie, J. Callebert, J-M. Launay, D. He´nin,P. Soler and B. Crestani. Modulation of bleomycin-induced lung fibrosis by serotonin receptor antagonists in mice. Eur Respir J,2008; 32: 426-436
8 Nveed I. Chaudhary, Andreas Schnapp, John E. Park. Pharmacologic Differentiation of Inflammation and Fibrosis in the Rat Bleomycin Model. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,2006;173
 

 


 

 

 

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