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病理学技术的发展和我省的现状


更新时间:2006-04-22 08:38:36 作者: 中山大学附属第一医院病理科  基础医学院病理教研室  梁英杰

 

病理技术是病理学诊断和研究不可分割的一部分,各种各样的病理技术能够精细地提供组织、细胞、分子等多方面多层次的信息,使病理学诊断和研究有了更加科学、准确和可靠的形态学和分子生物学依据,提高了诊断的正确率,加深了我们对疾病的病因、病理变化和疾病发生发展过程规律性的认识, 促进了病理学的飞速发展。从1964年广东省病理学会成立初我省只有20多个病理科室,到目前不完全统计共有300多个病理科(室),我省病理学技术也经历了几十年有了很大的发展。

一、常规的HE染色技术是最基本的也是最重要的染色技术,无论其他病理技术的发展应用程度如何,在病理学诊断和研究中都离不开该技术。近年来不少实验室配备和使用了先进的仪器设备,如全自动封闭式组织脱水机的应用,提高了组织蜡块制备的质量;自动组织石蜡包埋机和塑料包埋盒的应用,方便了组织蜡块的切片和再次切片,也使得组织蜡块更易于归档。自动染色机和自动封片机的使用,在改善工作条件的同时也提高了工作效率和制片质量。低温恒冷切片机逐步代替了二氧化碳制冷等方法应用于冰冻切片技术,制片速度快,质量高。

二、特殊染色和酶组织化学技术可以显示组织细胞中在HE染色观察不到或难以观察的一些特殊的物质和结构。20年前,病理诊断除了主要依据常规HE 切片外,还需要依据一些特殊染色切片,如在冰冻切片的卵泡膜细胞瘤诊断中,常用苏丹特殊染色法显示脂肪;在肾穿刺活检病理诊断中,Masson三色、PAS、PAMS是常规应用的特殊染色方法。在三甲和二甲医院评定时,这些等级的医院都被要求开展特殊染色技术,所以特殊染色技术在不少医院已经开展,但开展的数量不多。酶组织化学技术由于受到取材的限制,绝大多数的酶只能在冰冻切片中显示,因此,很少用于病理诊断,多数用于研究实验。随着免疫组织化学技术的发展和应用,逐步代替了许多特殊染色和酶组织化学技术,但是由于特殊染色具有简单、快速和成本低的特点而一直被应用,而且许多特殊染色是免疫组织化学技术所不能代替的。2000年由我省医学会主办、病理学分会技术学组主持了国家级继续教育项目“病理特殊染色技术”, 说明我省开展特殊染色技术在全国处于领先地位。

三、20世纪80年代开始免疫组织化学技术在我省推广应用,由于PAP法和ABC法等敏感性高,不仅能检测到冰冻切片的组织抗原,而且能够应用于石蜡切片,使得免疫组化技术广泛应用于病理学研究特别是回顾性研究和临床病理诊断,并显示出巨大潜力。到了20世纪90年代,出现了许多新的更敏感的技术方法如LSAB(S-P) 法,由于LSAB法比PAP法和ABC法等敏感性更高, 因此近十年LSAB法基本取代了PAP法和ABC法成为主要的常用方法。免疫组化技术已经在病理诊断尤其是肿瘤鉴别诊断中起着重要的作用,如在淋巴造血系统疾病的诊断中,如果没有应用免疫组化技术,不仅相当一部分淋巴瘤无法确定类型,部分淋巴组织增生性疾病的性质也可能无法得到证实,甚至造成误诊;同时在病理诊断中应用免疫组化技术检测肿瘤组织的相关抗原对指导临床治疗和预后提供了重要的参考依据,例如CD117和HER-2免疫组化检测对选择胃肠间质瘤和乳腺癌的治疗方案起了关键的作用。 1992年在中华医学会病理学会第三次全国病理技术学术会议上我省的代表首先介绍了微波抗原修复技术, 热修复技术的开展大大提高了免疫组织化学技术的敏感性,更为重要的是以前认为石蜡切片中已失去活性的抗原通过热修复在石蜡切片中被显示出来,从而使大多数抗体能够应用于石蜡切片中。目前抗原修复技术是大部分抗体免疫组化染色必不可少的技术。由于免疫组化染色操作的每一步骤和环节均会影响染色结果 ,此外不同厂家生产的抗体和检测试剂其质量和敏感性都存在差异,这些原因都可能造成染色结果的假阴性或假阳性,而且目前还没有一种对某种肿瘤完全特异的抗体,而同一种抗原往往又在多种肿瘤中表达,因此,免疫组化技术在病理诊断中有一定的局限性。目前常用的免疫组化染色法--LSAB法和重要的微波抗原修复技术都是在我省首先开展和应用,因此我省的免疫组化技术在全国具有较大的影响力。

四、分子病理学是应用分子生物学一些基本技术,结合病理形态学的特点,将核酸原位分子杂交、聚合酶链反应(PCR)、原位PCR、核酸测序等应用于病理研究和诊断,从蛋白质、mRNA 和DNA 水平揭示疾病的发生、发展规律以及病因学和发病机制,并希望在疾病早期诊断, 判断预后, 治疗和预防上找出途径和出路。在病理诊断中常应用HPV核酸原位分子杂交检测女性生殖道感染疾病的诊断和判断病变的高危、低危性,EBV 检测则已广泛用于鼻咽癌、淋巴瘤和传染性单核细胞增多症的诊断。用TUNEL方法进行肿瘤组织凋亡细胞DNA片断末端原位标记,深入研究肿瘤细胞凋亡的机制和基因调控,有助于进一步探讨和揭示肿瘤的发生机制, 通过利用药物调控肿瘤细胞的凋亡而达到治疗的目的。荧光原位分子杂交(FISH)技术是用荧光素标记的DNA探针,检测特异DNA序列,不仅能具有快速、稳定、敏感性高的特点,而且能通过用荧光显微镜观察发出不同颜色的荧光,在同一细胞核内确定不同的靶DNA序列在染色体相对应的位置,不但可以检测间期细胞核的DNA还可以检测中期核分裂象的染色体。随着FISH技术的成熟和试剂的商品化FISH已成为基因定位常规的手段,为肿瘤病理学癌基因与抑癌基因的定位以及癌基因的激活和抑癌基因失活的研究提供了新的有效方法。PCR是一种能够高敏感、高特异和快速地将DNA片段在体外扩增的技术方法,已经成为分子病理学的一个强有力的手段,被列为20世纪90年代生物学技术十大热点之首,已被广泛应用于分子克隆、DNA序列分析、癌相关基因的检测 、遗传病和分子病理诊断等多个领域。用PCR扩增单链DNA后再用SSCP(单链构象多态性)和RFLP(限制性片段长度多态性)技术进行分析,即PCR-SSCP,PCR-RFLP技术,是基因突变研究最有效的技术之一。通过p53、p16、ras、neu和myc等基因的检测和分析,有助于研究肿瘤发生发展的机制和肿瘤的病理诊断。对有基因缺失的遗传病可根据PCR扩增后靶基因片段的有无直接作出诊断。我省也有实验室已经应用PCR技术检测瘤细胞的基因重排诊断淋巴瘤。荧光定量PCR技术是利用荧光素标记探针,PCR扩增时会发出荧光,通过检测荧光的强度可实时监测PCR 反应,定量精确,易于标准化。该技术解决了PCR 产物的污染和PCR 模板定量的问题,在临床观测患者病情发展及预后,判断药物疗效等方面的用途和前景十分广阔。

五、尸体解剖也是病理学的一项基本技术,近几十年有了较大发展,但解剖数量仍然不大,开展这项工作最多的单位30年累积数量不超过1万例,与1974年美国全国一年完成35万5千多例的的尸体解剖相比差距较大[3],而且近年来尸体解剖仍然处于下降趋势,不利于教学和科研的发展。

六、在病理学研究和诊断中已经离不开光学显微镜,但是其分辨率和有效放大倍数的限制已经满足不了对细胞超微结构的观察。电子显微镜问世后,电镜技术有了很大的发展,电镜技术除了应用在超微病理研究中,在病理诊断中主要应用在肾小球微小病变和各亚型肾小球肾炎的诊断;通过观察肌浆内线粒体的畸形使某些肌病确诊,这在我省几家大医院也有开展。但迄今为止还没有发现肿瘤或恶性肿瘤的特异性超微结构,因此,电镜技术还不能有效地应用于肿瘤与非肿瘤、良恶性肿瘤的鉴别诊断。

七、20世纪80年代初激光扫描共聚焦显微镜问世,它在显微镜高分辨率成像的基础上加装激光扫描装置对组织内或细胞内部微细结构进行光学非侵入式分层扫描, 然后通过计算机进行图像处理,迅速完成对图象立体、多层面、动态的全面观察,再转换成具有三维效果的图像从屏幕上显示并拍摄。激光扫描共聚焦显微镜是当今生物组织形态学研究的先进手段之一,在整个生物学研究领域都有着广阔的应用前景。激光扫描共聚焦显微镜价格昂贵,我省目前还没有一个病理科拥有这种显微镜。

八、诊断细胞学的涂片制作和染色技术一直使用传统的方法,传统的宫颈涂片制作有近80%以上的细胞包括异常的细胞未能收集在玻片上,而且制片质量不佳,有诊断价值的细胞重叠严重,或被炎症细胞、血细胞和黏液等遮盖而影响诊断。近年来液基薄层细胞学制片技术的应用使细胞学涂特别是宫颈涂片制作技术有了很大的发展。液基薄层细胞学制片技术包括膜式液基薄层细胞技术(Thih-prep Cytolosy Test, TCT)和离心沉淀式液基薄层细胞学制片技术(AutoCyte Prep),制作出的涂片几乎可以收集到取样器上的所有细胞,细胞呈单层平铺,背景清晰少有血细胞和黏液等的干扰。与传统涂片相比,异常细胞的检出率有了显著提高。液基薄层细胞制片技术与TBS(The Bethesda System)报告方式结合在宫颈病变筛查及诊断中起着越来越大的作用。该技术还可用于非妇科标本,如尿、痰、体腔渗出液、支气管冲洗液、食管拉网标本以及细针穿刺的标本检测。近一两年在我省有了较快的发展,但是该技术仪器和耗材成本较高,在一定程度上影响了技术推广和普及。

我省的病理技术经过了几十年的发展,但不同地区病理实验室的发展还很不平衡,不少技术员学历偏低,有的技术员是由护士或工人转来,不少单位常规HE切片制作质量不高,特殊染色技术很少或没有开展,免疫组化染色结果也很不稳定,这些都容易给医生的诊断带来困难,甚至造成误诊,引起医疗纠纷。可喜的是,近年来大专和本科毕业生也加入到技术员队伍,技术员本身通过业余学习获得了大专或本科学历,为数不少的技术员通过进修学习,技术水平和素质都有了很大的提高。病理学分会技术学组每年举办的技术培训班、技术讲座和制片质量讲评,对我省病理技术的发展起到了促进作用。

病理学诊断和研究的发展,离不开各种相应技术的支持,而制片质量的好坏很大程度上影响病理医生作出正确的病理诊断和对实验结果的判断。因此除了殷切希望有关领导重视和关心技术工作外,广大病理技术人员也要有使命感,应该不断学习和掌握日新月异的病理学技术,工作精益求精,为病理学的发展作出应有的贡献

 

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