当前位置:技术讲座 > 免疫荧光技术在肾脏病理中的应用
 

免疫荧光技术在肾脏病理中的应用


更新时间:2006-04-22 08:38:39   作者南方医科大学附属南方医院肾脏病研究所  周展眉

 

肾穿活检的标本主要来源肾移植、肾病两种,而这两种情况活检标本都相对较小,而要做的检查相对较多,因而需将标本分成三份,(1)常HE及特殊染色(2)冰冻切片(3)电镜检查等,因此,肾穿样本的取材和制作直接影响最后病理诊断。下面对肾穿标本取材及制作的关键问题作分析和讨论。

自1961年Dixon开始在肾脏疾病中应用免疫荧光技术以来,对肾脏的免疫病理的研究起了重要的作用。在肾脏病的临床和科研工作中,它对肾小球发病机理和免疫分型,组织学检查的诊断和鉴别诊断都有十分重要的的作用。如果没有过硬的免疫荧光技术就无法开展肾活检病理诊断工作,因为它直接影响了50%以上的结论。

免疫荧光染色具有特异性强、敏感度高、染色步骤简单、节省时间、对荧光标记物的分布部位、公布形式荧光的强度显示极为明确等优点。免疫荧光技术除了受试剂的特异性、敏感性的影响除外,良好的技术质量与制片质量是检测成功的重要保证。

一、免疫荧光的原理

需要检测的标本中是否存在某种抗原时,以IgG为例,用FITC(异硫氰酸荧光素)标记的动物抗人的IgG抗体,直接滴在待检肾组织上。若肾组织中有欲测的抗原IgG存在时,则与荧光抗体IgG结合,在荧光显微镜下显示黄绿色的荧光。简而言之其原理就是抗原抗体的特异性结合。

a: 含IgG的免疫复合物 b:兔抗人的IgG血清 c:荧光素
直接免疫荧光法原理图(图)
a:含IgG的免疫复合物 b:兔抗人IgG血清 c:羊抗兔IgG血清 d: 荧光素   间接免疫荧光法的原理图(图)

选自邹万忠《肾活检病理学》


二、免疫荧光法的技术与方法

冰冻切片的免疫荧光染色法

1. 取材
(1)将刚取得的肾组织置于滴有生理盐水的切
割板上。


分割0.1cm×2做电镜 0.2 cm×4做免疫荧光 1.5 cm做光镜
我院的肾活检标本取材法

肾活检标本的取材(北医方法)
A、B:一条肾组织 C:两条肾组织  左:皮质端 右:髓质端  a 电镜 b 荧光 c 光镜
选自邹万忠《肾活检病理学》
(2)将用于免疫荧光检查的肾组织放于3×3cm的盐水纱布中包好,放入EP管(大炮弹)中 。
(3)将其放于盛有化学冰的密闭保温壶中(低温)约4℃暂存,不能超过2个小时。
(4)尽快做冰冻切片,若暂时不能切片的组织必须放于-20℃冰箱中,需切片时方可解冻。
2 冰冻切片
将OCT滴于金属支持器上冷冻凝固,用小镊子尾部抹出一个平面,将几小块肾组织摆在平面上包埋,力求切到最大面的肾组织。切片温度为-30℃,切片厚度为5um。
3 荧光染色的步骤(直接法)
(1)将冰冻切片置于抽湿机旁室温干燥30分钟或吹风筒冷风吹干10分钟。
(2)滴加标记荧光抗体将切片置于湿盒内(盒内 加入适量的水防止切片干燥)。
(3)37℃孵育45分钟、室温2小时或4℃过夜。
(4)用双蒸水洗片2分钟×3次。
(5)于4℃冰箱避光放置,可放置2-4周。
(6)用荧光显微镜镜下观察。
4 荧光染色的步骤(间接法)
(1)将冰冻切片置于抽湿机旁室温干燥30分钟或吹风筒冷风吹干10分钟。
(2)滴加一抗将切片置于湿盒内(盒内加入适量的水防止切 片干燥)。
(3) 37℃孵育45分钟、室温2小时或4℃过夜。
(4)PBS洗2分钟×3次。
(5)滴加荧光素标记的抗一抗动物的IgG抗体。
(6)37℃孵育1小时。
(7)双蒸水洗片2分钟×3次。
(8)于4℃冰箱避光放置,可放置2-4周。
(9)用荧光显微镜镜下观察。
三、免疫荧光结果的观察

选自邹万忠《肾活检病理学》

选自邹万忠《肾活检病理学》


四、免疫荧光技术具体操作中的注意事项
肾活检组织冰冻标本良好地制备对于组织形态的完整、免疫荧光的正确判断、组织中的抗原活性的保存和组织的长期保留均是至关重要的。
1. 取材时要合理分割标本。
如果留取的荧光标本上没有肾小球将对许多肾病病理诊断造成很大影响。皮质端肾小球较多,颜色淡红,有针尖样的红点。髓质端颜色较红,没有肾小球。取材时选择皮质端,免疫荧光组织最好能有2-5个肾小球。
2. 分割标本的时候要将组织浸泡在生理盐水中,防止组织干涸。分割刀要锋利,夹取标本不要留下夹痕。
3. 分割标本后因要留取电镜、光镜和免疫荧光的 标本并固定,要避免固定液的交叉腐蚀,要用纱布擦干净小镊子上的固定液方可夹取做免疫荧光的标本。
4. 包标本的盐水纱布不宜过大,防止放入炮弹内挤压到组织。盐水纱布不宜太湿,组织容易自溶。太干标本会干涸,以拧不水为宜。标本应尽早切片,如果次日或过两天切片应将标本放于-20℃冰箱保存,需切片时方可解冻,严禁组织标本反复冻溶。反复冻溶的组织肾小球、小管结构模糊,抗原减弱或消失,导致荧光标记失败或非特异性着色增加。
6. 切片不用要求过薄,5um较为合适。切片过薄抗原含量太少不宜检出。
7. 冰冻切片包埋时要将包埋剂滴于金属支持器上凝固后修平,再将数块小的肾组织平放在包埋剂上包埋切片。
8. 新购的免疫荧光抗体在使用前要确定工作液的浓度(参考说明书)做好免疫试剂阴性、阳性的质控对比染色。染色结果以阳性部位着色清晰、背景不着色为宜。
9.抗体的使用要现用现配,对于效价低的抗体(工 作液浓度在1:20以下)使用前要1000r/min,离心1-2分钟以去除沉渣;滴加抗体时要覆盖住组织并略多些,以减少边缘效应的非特异性着色;4℃过夜的方法,可提高阳性并降低背景;
10. 荧光抗体孵育完后最好用蒸馏水清洗切片,防止PBS干燥后盐类夹带荧光素污染切片。
11. 切片可以不用封片,但要4℃冰箱避光保存。看 片前用冷风吹干。
五、石蜡切片在免疫荧光中的应用
冰冻切片免疫荧光染色在肾活检病理诊断中起着重要的作用。但冰冻切片需要昂贵的冰冻切片机,很大程度上限制了该技术的广泛应用。冰冻标本留取量较少易没有肾小球而影响病理诊断。所以许多医院都应用石蜡切片来做免疫荧光染色并取得了良好的效果。
石蜡切片免疫荧光法
1. 石蜡切片脱蜡至水;PBS洗3次;
2. 微波炉抗原修复:将切片置于二胺四乙酸(EDTA)抗原修复液内(PH8.0),705-800W,中央加热(95°C)10分钟,室温冷却30分钟,PBS浸洗10分钟;
3. 滴加胃蛋白酶,湿盒内37°C10分钟孵育, PBS浸洗10分钟;
4. 无关动物血清封闭室温20分钟;倾去,勿洗;
5. 滴加荧光素标记的抗体37°C30分钟, PBS洗3次,每次2分钟;
6. 甘油封片,荧光显微镜镜下观察;

石 蜡 切 片 免 疫 荧 光 染 色               选自邹万忠《肾活检病理学》
北京301解放军总院染色方法:
石蜡脱蜡入水 3%H2O210分钟 抗原修复 室温放置20分钟 PBS洗5分钟 滴加标记了荧光素的抗体室温40分钟 PBS洗5分钟 滴加甘油封片荧光镜下观察。

七、免疫荧光技术的优缺点(与其它酶标技术的比较)
固有抗原保存较好。
较好的避免了血液里的抗原的污染。
避免了内源性生物素的干扰。
不便长期保存。
 

 

精 彩 文 章 链 接