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肾穿活检组织标本制作与染色


更新时间:2006-04-22 08:38:34   作者:广东省人民医院病理科 姚军 朱小兰 张威

 

一﹑取材
肾活检标本经皮质穿刺取检,分皮质和髓质,在解剖显微镜下,肾皮质组织色较淡,肾小球为如针尖大小的红色小点,不规则分布。穿刺所得的组织,一般包括以下几种成分:皮质组织;皮髓交界组织;皮质-髓质-皮质组织。

肾穿标本检测项目   1.电镜标本  2.免疫病理:新鲜活检   3.常规

二﹑固定
固定液:  常规:10%中性福尔马林。  电镜: 3%戌二醛。
固定时间:最好不低于8小时。

三﹑ 脱水、包埋、切片   
随常规脱水机脱水,尽量用小包埋模块包埋,以利于连续切片。切片厚度1-2um,烤片温度60℃。1小时。

四﹑HE染色:
观察组织学和细胞学形态,通过它能显示整个疾病的全貌,明确病变的性质和分布的特点

五﹑染色结果   
肾小球轮廓清晰,细胞核、质蓝红对比鲜明,各种细胞成分着色鲜艳。

特殊染色
六氨银染色 肾小球肾炎的病变主要表现在肾小球,尤其是肾小球基膜的改变。常规HE染色不能清晰地显示基膜,主要通过PAMS染色才能将基膜清晰地显示出来。

染色原理:
肾小球基膜富含粘多糖,必须经过氧化才能暴露醛基,醛基把六胺银还原为黑色的金属银。

试剂配制 (1)1%高碘酸水溶液 (2)5%铬酸水溶液 (3)2%草酸水溶液 (4)3%六次甲基四胺水溶液 (5)5%硝酸银水溶液 (6)5%硼砂水溶液 (7)0.1%氯化金水溶液 (8)3%硫代硫酸钠水溶液

方法 (1)1%高碘酸氧化10min,蒸馏水洗。 (2)5%铬酸氧化20min,蒸馏水洗。 (3)2%草酸泡洗 1min,蒸馏水洗三次。 (4)新鲜配制六胺银溶液(六胺银染液:3%六次甲基四胺 水 20ml , 5%硝酸银 1ml , 四硼酸钠 2.4ml)用50ml规格的染色玻璃缸750W微波炉的中低档预热。 (5)将切片置入六胺银溶液中于60度水浴箱中孵育15~25min (6)蒸馏水漂洗3次。 (7)0.1%氯化金调色1~2min,蒸馏水洗。 (8)3%硫代硫酸钠处理1~2min,蒸馏水洗。 (9)复染苏木素,伊红 (10)常规脱水,中性树胶封固

结果: 肾小球及肾小管基膜呈深黑色, 胞核呈蓝色,肾小管上皮呈浅红色,颜色鲜艳,背景清晰,对比效果好。

体会:

1.氧化是基膜染色的前提。单用1%高碘酸或8%铬酸氧化的组织,基膜着色不如双重氧化的组织深,可能与醛基未充分暴露有一定的关系。

2. 温度是六胺银染色必不可少的条件。六胺银染色对温度的要求较高,温度达不到60℃,组织不起反应,温度过高或在60 ℃水溶箱搁置时间过长,溶液易氧化变混浊出现黑色氧化膜。

3.染色时间和银的浓度是控制染色质量的关键。六胺银染色是一种退行性染色,但浸染时间掌握不好易导致染色的失败。浸染时间过短,基膜着色浅,经氯化金及硫代硫酸钠处理后,基膜呈浅棕色,不利于观察病变。浸染时间过长,组织切片表面附着一层黑色反光膜。

二﹑ Masson三色染色
Masson三色染色主要是用来观察肾小球嗜复红蛋白沉积物(免疫复合物)及肾脏内胶原纤维增生等。
我科采用改良后方法,通过组织切片的补充固定,试剂浓度的改良组合、调整染色时间。对肾穿活检切片进行了新旧两种方法的试验比较,取得了较为满意的效果。

试剂配制
(1)改良后Bouin液:饱和苦味酸96ml,甲醛32ml,冰醋酸6ml。
(2)重铬酸钾液;重铬酸钾2.5克、蒸馏水95ml、冰醋酸5ml。
(3)天靛石蓝液:天青石蓝1.5g、硫酸铁铵5g、纯甘油14ml、 蒸馏水100ml、麝香草酚50mg。
(4)lille Mayer苏木素液:蒸馏水700ml、硫酸铝钾50g、苏木 素5g、碘酸钠0.5g、甘油300ml、冰醋酸20ml。
(5)丽春红液:丽春红1g、蒸馏水99ml、冰醋酸1ml。
(6)酸性品红液:酸性品红1g、蒸馏水99ml、冰醋酸1ml。
(7)磷钼酸液:磷钼酸1g、蒸馏水99ml、冰醋酸1ml。
(8)亮绿液:亮绿1g、蒸馏水99ml、冰醋酸1ml。
(9)0.2%冰醋酸溶液:(临用前配制)

方法
A 组改良方法:
(1)切片常规脱蜡至蒸馏水
(2)切片置入Bouin液固定液第二次固定,常温下过夜或水浴温箱加温600C lh。流水冲洗至黄色消失,蒸馏水洗。(3)切片经重铬酸钾溶液600C 15min,切片流水冲洗10min,蒸馏水水洗。
(4)天青石蓝液染10min蒸馏水冲洗。
(5)苏木素染液10min,流水冲洗,
(6)滴加丽春红染液:丽春红、酸性品红混合液(2:1)(临用前配制)染20-30min。
(7)切片0.2%醋酸水溶液洗涤,0.1%磷钼酸分化,胶原纤维淡红色即可。
(8)切片滴加1%亮绿溶液,染1-2min,0.2%醋酸水溶液洗涤。
(9)经95%乙醇、无水乙醇1.2脱水、透明、中性树胶封片。
B组常规方法:
固定液及染液配方未改变,染色时间照旧,切片未经重铬酸钾氧化,,其余染色步骤与A组相同。以上A、B组的操作第6步骤至第8步骤均需在显微镜下控制调色。
两种方法 条件比较

结果:

A组:改良Masson三色染色结果显示图A:肾小球基膜沉积物(免疫复合物)呈红色。基底膜、系膜、胶原纤维呈绿色,肾小管管腔胞浆、胞质、红血球呈鲜红色,细胞核呈棕褐色。
B组:常规方法染色显示,基底膜、系膜、胶原纤维与免疫复合物和胞质、胞浆、对比染色不鲜艳,部分结构显色不清晰,图B

体会
Masson三色染色,主要用于区分胶原纤维和肌原纤维,而在肾穿活检标本中也是用于显示肾小球沉淀的免疫复合物和基底膜、系膜基质及胶原纤维等。由于肾小球组织结构特别精细复杂,加上病变部位变化极多,所以三色染色显示肾小球组织结构的变化要求准确、快捷、清晰。
三色染色效果的成效关键是在于组织对固定液的选择和显微镜下的调色技术的发挥。
 

补充固定剂的作用
Bouin氏固定液以苦味酸为主要溶剂、能迅速沉淀组织中的蛋白质,组织结构完整。苦味酸固定的组织密度疏松,保持组织结构孔隙宽,渗透性高的特性,有利于大分子染料对组织的浸透。丽春红、酸性品红、亮绿则是属于较大分子的酸性染料。
 

重铬酸钾氧化作用
改良后的Masson方法,加大了固定液苦味酸的含量并适当提高了温度条件使组织的浸透加快。
补充了重铬酸钾溶液对结缔组织细胞质,线立体、高尔基体的固定效果[5]。
由于氧化的作用,使基底膜的蛋白质和粘多糖充分暴露醛基。酸性染料对组织着色的亲和力得到加强。

酸性染料含量提高的作用
由于酸性染料丽春红、酸性品红染色溶液浓度含量分别提高了30%~2倍,并且把染色比常规方法延长了2倍时间,红细胞、细胞质、细胞浆及免疫复合物的鲜艳度明显得以提升。
作为细胞核的媒染剂天青石蓝的含量比原常规方法提高了3倍的浓度,因为天青石蓝成份中含有高铁盐,与Mayer氏苏木素结合使用,就具有较强抗酸性能力。

小结
改良后Masson三色染色对多种组织成份显色对比非常清晰、艳丽。不仅能准确显示肾小球基底膜系膜基质,胶原纤维和有否免疫复合物的沉积,并且易识别沉积的部位和病变范围。
对肾脏疾病的病理诊断和描述具有很大的技术支持作用。亦适用于所有的常规结缔组织特殊染色。

3﹑高碘酸-无色品红

在肾小球疾病中,常导致肾小球基底膜的改变,HE染色无法清晰显示基底膜,PAS对显示基底膜的诊断有一定意义。

             

 

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