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浅谈苏木精
 


更新时间:2007-04-04 11:18:28 作者: 中山大学医学院病理学教研室 凌启波

 

石蜡切片苏木精伊红(HE)染色技术是病理解剖学、组织胚胎学、法医学和生物学等领域最基本的技术操作。掌握好HE染色,也为其他染色如特殊染色、酶组化染色和免疫组化染色等技术打好基础。对于苏木精,应该有一个全面的了解,才能对常规的HE染色灵活掌握,运用自如,染出一批批理想的HE玻片标本。

一、苏木精的性质

苏木精,又称苏木素,苏木色精(Hematoxylin),C16H4O6,分子量302.288。它是一种无色或淡灰黄色粉末,市售有无水和含3H2O两种;苏木精若存放过久,接触空气,颜色可慢慢加深,用其配制苏木精染液就不理想;它易溶于乙醇、乙二醇和甘油,微溶于水;它本身不是一种染料,没有染色性能,需要经过氧化和媒染后,才成为一种很好的细胞核染料。

苏木精是一种天然植物,是以中、南美洲产的一种植物称洋苏木树(hematoxylon campechianum)的淡红棕色的心材中提取出来的一种天然变色物质。早在300多年前,苏木精的抽提物就输入欧洲,在纺织工业上用作丝织物和羊毛的染料。后来,Waldeger(1863)开始用于组织学的染色,苏木精就成为一个十分重要的生物学染色剂。

Boehmer(1865)从染色工业上得到启发,以明矾(硫酸铝钾)和苏木精结合作为细胞核的染色剂,称明矾苏木精(alum hematoxylin),立即得到广泛认可,并确定了铝盐作为媒染剂。随后有很多改良方法,如通过加入乙醇使苏木精易溶和防霉菌生长,加入甘油保持染液的质量稳定,使用不同的铝盐,加入各种化学氧化剂和促进酸化等。

洋苏木树心材抽提出来的苏木精不是一种活性物质,从分子结构上,苏木精没有发色团,所以它本身不是染料,没有染色能力。但其溶液放置后,由于氧化作用使其成为一种有色的氧化苏木精,称苏木红(hematein),才成为一种染料。所谓氧化,就是使苏木精分子结构失去两个氢原子,并在其中的一个苯环转化成具有一个醌型苯环的苏木红,这个过程又称成熟(ripening)

醌型苯环是一个发色团,这样,在苏木红的分子结构中,原有助色团羟基 ,又有了发色团醌型苯环,就成为一种染料。

二、  苏木精的氧化

苏木精需被氧化为苏木红,才成为一种染料。苏木精的氧化有两种方式:

1.自然氧化:是指配制苏木精染液时,不加氧化剂,苏木精通过空气和阳光的作用而被自然氧化成苏木红,这过程需数周至数月。这种自然氧化所配制的苏木精染液的保存和使用寿命较长。

2. 人工氧化:是指在配制苏木精染液时加入一定量的氧化剂如氧化汞、碘酸钠、高锰酸钾或过氧化氢等可立即使苏木精氧化成苏木红。但要注意加入氧化剂的量不能太多,不要使苏木精分子全部氧化变成苏木红,否则,苏木精染液的使用寿命就较短。加入氧化剂过量时造成氧化过度,破坏了苏木红的分子结构,导致苏木精液的染色力减弱甚至失效。

一种成熟的苏木精染液是苏木精、苏木红、苏木红的活性氧化产物和非活性的超氧化产物的混合物。如过度氧化,可导致大量非活性超氧化产物产生,这些产物是无色和无用的。因此,在配制苏木精染液时,精确地加入恰当的氧化剂和量是重要的。

早期传统用氧化1g苏木精所需氧化剂的量是:

氧化汞 500mg

碘酸钠 200mg

高锰酸钾 177mg

过氧化氢 2ml

在实践中,这个量配制的苏木精染液都较理想,但使用寿命不很长,染液的染色力就慢慢减弱而需重新配制。

近年有学者提出用较少量的氧化剂来配制苏木精染液,其染色效果亦佳,苏木精染液的使用寿命延长。他们推荐1g 苏木精所需氧化剂的量是:

氧化汞 100mg

碘酸钠 40~100mg

高锰酸钾 90mg

高碘酸钠 35mg

碘 200mg

高碘酸钾 50mg

理论上,1g苏木精·3H2O完全氧化成苏木红需用碘酸钠185mg,而1g无水苏木精完全氧化则需用碘酸钠218.2mg。Gill提出半氧化苏木精法,即氧化1g苏木精仅用碘酸钠100mg,这样先使部分苏木精氧化成苏木红,未被氧化的苏木精在随后的日常染色操作中慢慢氧化成苏木红。这样,染液既不会过染,又经常有新的苏木红形成补充,苏木精染液的使用寿命就可延长。

在几种氧化剂中,很多学者都首选碘酸钠。其优点是在室温下易溶于水,不需煮沸就能放氧。氧化后,产生的碘化钠是无害的,也是可溶的,染液的稳定性好。而氧化汞需要在苏木精染液煮沸时加入才能放氧,当开始放氧时又要立即把染液置入冷水中终止放氧。随后苏木精染液每天都会在液面形成一层金属膜,需要把染液过滤后才能用以染色,而汞盐也是一种毒性物质。

苏木精的氧化与下列因素有关:

1.苏木精染液PH值。染液偏碱性氧化快,中性时稍慢,酸性时很慢,所以加酸时的苏木精染液可延缓氧化。

2.氧化剂的量。加入人工氧化剂后苏木精可立即被氧化成熟可用。自然氧化和供氧量有关。如靠近阳光、染液通风、经常摇动等可加速氧化。

3.氧化时苏木精液的温度。用碘酸钠等作氧化剂时,在常温下加入即可,而用氧化汞作氧化剂时,需把苏木精液煮沸时加入才能放氧。

三、苏木精的媒染

苏木精被氧化成苏木红,苏木红为弱酸性,呈红色,对组织的亲和力很小,用单纯的苏木红液染组织,和一般酸性染料一样呈弥漫性染色,且染色浅淡。但当加入某些物质如二价或三价的金属盐如铝、铁盐后,染料分子就能与这些金属盐的离子结合形成色淀(lake),这种色淀具有阳电荷,能与特定的组织成份牢固结合。这些二价或三价的金属盐就称为媒染剂(mordant)。

用作媒染剂的多是二价或三价的金属盐如铝、铁盐,也有采用碘、钨、钼、锂、铅和铬等。

常用的媒染剂有:
      硫酸铝钾又称钾明矾   K2SO4 · Al2(SO4)3 · 24H2
      硫酸铝铵又称铵明矾  (NH4)2SO4 · Al2(SO4)3 · 24H2O
      硫酸铁铵又称铁明矾  (NH4)2SO4 · Fe2(SO4)3 · 24H2O
      硫酸铝              Al2(SO4)3 · 18H2O,
      三氯化铁            FeCl3 · 6H2O
 

苏木红和这些铝盐结合形成蓝紫色的色淀,如Ehrlich苏木精染液、Harris苏木精染液、Mayer、Carazzi、Lillie-Mayer和Gill苏木精染液等;苏木红和铁盐结合形成蓝黑色的色淀,如Weigert和Heidenhain铁苏木精染液等。这些色淀和胞核结合得很牢固,用水或乙醇均难以洗脱,Weigert铁苏木精染液更作为耐受酸性分化和用较强酸性染料复染的首选胞核染料。

苏木精是一种天然染料,其化学结构式已为大家认可,但其染色机制还不很明确。从苏木红的结构式看,原有助色团羟基,又有了发色团醌型苯环,应属一种酸性染料,但由于酸性助色团羟基的酸性很弱,对组织的亲和力较小。加入媒染剂铝盐后,铝盐与苏木红螯合形成蓝紫色的铝-苏木红色淀,该色淀呈强盐基性,带正电荷,作用相当于碱性染料,即带正电荷的蓝紫色色淀和带负电荷的胞核脱氧核糖核酸磷酸基进口极性吸着而完成染色。


(根据J.R.Baker)

四、用铝盐作媒染剂的苏木精染液配方

 














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Boehmer-Schmorl 5g 60ml   1000ml 100g                
Delafield 4g 125ml     饱和水溶液400ml         100ml      
Ehrlich 6g 300ml   300ml 9g*         300ml 30ml    
Hansen 5g 50ml   1000ml 100g   1%94ml            
Harris 5g 50ml   1000ml 100g     2.5g          
Mayer 1g     1000ml 50g       0.2g     1g 50g
Carazzi 1g     800ml 50g       碘酸钾0.2g 200ml      
Cole 1.5g     250ml 饱和水溶液700ml       1%碘乙醇50ml        
Lillie-Mayer 5g     700ml 50g       0.2~0.4g 300ml 20ml    
Gill 2g   250ml 730ml   17.6g     0.2g   20ml    

*9g为原作者用量,其后,许多作者建议用40g。

五.配制苏木精染液所需试剂的作用

1.氧化汞、碘酸钠:作为苏木精的氧化剂,使无染色力的苏木精氧化后转变成有染色力的苏木红。

2.硫酸铝钾、硫酸铝铵和硫酸铝:作为媒染剂,其三价铝离子与苏木红结合形成蓝紫色的色淀与细胞核内核酸的磷酸基牢固结合。 

3.无水乙醇:较快溶解苏木精,并可抑制霉菌生长。

4.乙二醇:也能较快溶解苏木精,抑制霉菌生长,其沸点高(b.p.197.2℃),苏木精液不易挥发。

5. 甘油:作为稳定剂,延缓苏木精染液蒸发,防止苏木精过度氧化,延长苏木精液的使用期。

6. 冰醋酸:可抵销氧化剂的氧化,使苏木精和苏木红保持均衡。同时又可增加胞核的选择性染色,使胞核染色质显示得清晰细致。

7.柠檬酸:作用和冰醋酸相同,加入柠檬酸1g,相当于冰醋酸20ml。

8.水合氯醛:起保护剂作用。

六、苏木精染液的检测

苏木精染液配制是否理想,可从以下几方面检测:

1.将几滴苏木精染液滴入一小盘自来水内,滴入的瞬间由红色转为紫色再转为紫蓝色慢慢扩散,则该苏木精液配制得好;若在扩散中仍保持红色,则为未足够成熟或陈旧的苏木精染液。

2.取一块滤纸滴入苏木精染液两滴,苏木精在滤纸上扩散后不久将呈一紫酱色的圆斑,在圆斑的周边最后呈深紫色,这是好的苏木精液。若周边不呈深紫色,说明该染液未够成熟或没有配好。

3.Ehrlich苏木精染液:配制得好时具有酒的香味,染液为深紫红色,轻摇盛瓶时染液有粘稠感。

4.理想的方法还是在实际操作中染一张淋巴结组织切片,在镜下观察其染色效果。

七、用不同金属盐作媒染剂的苏木精染液

苏木精染液名称 媒染剂 配制用试剂 染色结果
Weigert铁苏木精液 三氯化铁、盐酸 胞核棕黑色
Heidenhain铁苏木精液 硫酸铁铵 核仁、染色质、腺粒体、中心粒、肌肉横纹染蓝黑色
Mallory铁苏木精液 三氯化铁 胞核呈蓝黑至棕黑色
Weil铁苏木精液 硫酸铁铵 髓鞘、红细胞呈蓝黑至褐黑色,背景黄色
Verhoeff铁苏木精液 三氯化铁、碘、碘化钾 弹性纤维黑色
Mallory磷钨酸苏木精液 磷钨酸 纤维素、神经胶质纤维、横纹肌深蓝色,胞核、红细胞蓝色,胶原纤维、骨基质棕红色
Thomas磷钼酸苏木精液 磷钼酸、乙二醇、过氧化氢 胶原和粗的网状纤维呈紫至黑色,亲银细胞黑色,胞核淡蓝色。
Solcia铅苏木精液 硝酸铅、甲醛、醋酸铵 产肽激素瘤细胞颗粒呈深蓝至黑色,肌肉和神经也呈黑色。
Loyez锂苏木精液 碳酸锂 髓鞘、红细胞呈深灰蓝至蓝黑色,胞核也染蓝黑色,背景棕黄色
Weigert-Pal法 重铬酸钾、氟化铬 髓鞘、红细胞呈蓝黑至黑色,背景奶黄色。

苏木精染液通过加入不同媒染剂配制,或经媒染剂媒染切片后再染苏木精液,可显示不同的组织成份。

 

 

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