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肌肉活检的组织化学染色技术
 


更新时间:2007-04-04 15:13:26 作者中山医学院病理教研室 理科 


在临床检验中肌肉标本的送检仅占很少的一部分。但神经肌肉疾病主要依靠活检做最后确诊。
儿童的肌萎缩:
营养不良                 预后较差
               糖原/脂肪储积症            可针对性治疗
成人的肌萎缩:
神经源性                   对因治疗
               炎症性(如多发性肌炎)     激素治疗
一、 正常骨骼肌
我们首先来了解正常肌肉的组织结构。组织包括横纹肌、心肌、平滑肌。肌肉活检的组织主要是指骨骼肌组织。
 
1、  组织学结构
骨骼肌通过肌腱附着在骨骼上,每块肌肉有平行排列的骨骼肌纤维组成。致密结缔组织包裹肌肉形成外膜,内含神经血管(支配的神经受损,该束肌肉会发生萎缩);外膜分隔包围肌束形成肌束膜;包裹每条肌纤维的称为肌内膜。

骨骼肌细胞呈细长圆柱形,直径10100mm ,1~40mm。胞浆强嗜酸性,一条肌纤维有数十个甚至上百个核。磷钨酸苏木苏染色可见明暗相间的横纹(明带light band和暗带dark band)

横切面上正常成熟纤维不十分圆,呈多角形或多面体形状(图2)。细胞核通常位于周边,可见4~6个核
纤维直径:解剖学的原因:  强有力的、近端的——85~90mm
远端的、从事精细活动的、——(20mm);
生理原因:男性的大于女性;
 
         成年人的大于青少年
运动促使肌纤维肥大。
2、超微结构
肌纤维(肌细胞)→肌原纤维(明带和暗带)→粗肌丝、细肌丝
明带又I带(isotropic);暗带又称A带(anisotropic);暗带中央浅色的称H带;H带中央深色的是M线;明带中央深色细线称Z线。两条Z线之间的一段肌原纤维称为一个肌节。肌节:1/2 I+A+1/2 I 肌节长约2~2.5mm,是骨骼肌收缩的基本结构单位。

暗带由粗肌丝和细肌丝构成;明带只有细肌丝;

粗肌丝:由许多肌球蛋白分子排列而成,肌球蛋白形如豆芽,头部如豆瓣,形成横桥,横桥具ATP酶,能分解ATP释放能量,使横桥发生伸屈运动肌动蛋白丝的分子马达


细肌丝:肌动蛋白 由肌动蛋白单体缠绕形成双股螺旋链,有可以和粗肌丝上的肌球蛋白头部结合的位点
        原肌球蛋白
        肌原蛋白 由三个球形亚单位组成,其中一个是与钙结合的亚单位。



3
、骨骼肌纤维的收缩机制
发放神经冲动 钙泵活动浆内钙离子浓度升高 ++与细肌丝上的肌原蛋白结合 肌动蛋白位点暴露 与粗肌丝上的肌球蛋白头部接触,ATP酶激活,分解ATP释放能量,横桥屈曲将细肌丝拉向中间的M线,H带消失,肌节变短,肌肉收缩。

4红肌和白
在脊椎动物,骨骼肌可分为红肌和白肌。

 

红肌(Ⅰ型肌、慢纤维)

白肌(Ⅱ型肌、快纤维)

肌球蛋白

含量高

较低

线粒体

含量少

毛细血管

密度高

较低

糖原

功能

适合于有氧呼吸

无氧呼吸

 

持久收缩

迅速地和间断性收缩

分布(人类)

35%~40%

60%~65%


在低等动物可以仅有红肌或白肌一种类型。人类肌肉由两种纤维构成,混合镶嵌排列成“棋盘样”(checkerboard)结构。在身体里,I型和II型纤维的比例取决于肌肉在机体中的位置和它的功能,但一般的肌肉其纤维分布是II型纤维(60%~65%2倍于I型纤维

组化项目

作用

常用于辅助诊断的肌肉疾病

ATP

显示两型肌纤维

神经源性肌萎缩、脊髓性肌肉萎缩

NADH-Tr

显示线粒体分布

轴空病、中央核肌病、线粒体肌病

改良Gomori

显示线粒体

神经源性肌萎缩、线粒体肌病、肌营养不良

PAS

显示糖原

糖原储积性肌病

苏丹III

显示脂肪

脂肪储积性肌病

Dystrophin

显示抗肌萎缩蛋白

假肥大性肌营养不良(DMDBMD


二、活检肌肉组织的送检:
为保存酶的活性,手术后标本用生理盐水湿润的纱布包裹,置冰壶中尽快送检。(勿冰冻组织,切勿福尔马林固定
肌肉组织的冷冻处理
作用:使组织快速冷冻,避免切片冰晶形成。
冰晶形成是在病理诊断中被称为最难以避免和具有破坏性的人工假象。冰晶的空泡,可以与许多病理性空泡类似,而妨碍正确的诊断。
良好的冰冻肌肉切片:



人工形成的空泡常见于单个肌纤维中央,特点是分布于组织块周边。在很轻微的人工假象区域,每一根肌纤维内都有大小一致的小空泡。

     


异戊烷—液氮冷冻法:把盛有异戊烷的烧杯置于液氮中,见有白色凝结物时将肌肉组织放入冷冻约
10秒钟。
冷冻处理后组织可立即切片或置液氮保存。

三、冰冻切片
OT包埋剂包埋后切片。
1、  包埋动作要快,防止组织解冻;
2、  切片要取组织的横切面;
3、  切片可稍厚,7~10mm
4、  切片置-20℃保存。

四、ATP酶染色:
根据凌启波老师所著《实用病理特殊染色和组化技术》的钙激活法。
试剂配制
1、  碱性前孵育液pH10.0
   
0.1M巴比妥钠      2ml
    0.18M氯化钙       2ml
    双蒸水             6ml
2、  酸性前孵育液pH4.6
  
0.2M醋酸盐缓冲液(pH4.6 10ml
3
、底物孵育液pH9.4
   0.1M巴比妥钠      2ml
   0.18M氯化钙       1ml
   双蒸水             7ml
   三磷酸腺苷二钠盐   25mg
4
2%氯化钴
51%氯化钙
60.01M巴比妥钠液
   巴比妥钠           206mg
   双蒸水加至         100ml
   
7
1%硫化铵        300ml
    双蒸水           加至30ml
pH值要求高。试剂要求新鲜配制

染色步骤
冰冻切片吹风筒冷风吹干;标上AB记号。
1、  A片在碱性前孵育液中孵育15分钟;
2、  B片在酸性前孵育液中孵育5分钟然后入碱性前孵育液洗30
3、 
AB片入底物孵育液孵育30~45分钟;
4、 
1%氯化钙3分钟,共三次;
5、 
2%氯化钴3分钟;
6、 
0.01M巴比妥钠液洗4~5次;
7、 
流水冲洗1分钟;
8、 
1%硫化铵1分钟;
9、 
流水冲洗2分钟,过去离子水;
10
、常规脱水透明,中性树胶封固。 
结果

肌纤维类型

前孵育液pH10.0

前孵育液pH4.6

A

B

中度


注意制片放置一段时间会褪色,必要时及时摄影保存。

 
ATP pH 4.6深染的I型,      ATP pH 10.0深染为II型,浅染为I
IIa型,介于中间染色为IIb          型肌纤维
染色原理:

三磷酸腺苷酶水解三磷酸腺苷为二磷酸腺苷和磷酸,并释放出能量。磷酸与钙离子结合,在酶活性处形成无色的磷酸钙,磷酸钙经氯化钴处理形成磷酸,再经硫化铵处理形成棕黑色的硫化钴沉淀在酶活性部位。

五、NADH-Tr酶染色
还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸酶 (线粒体的氧化酶)
试剂配制
0.05M Tris   (pH 7.4)  5ml
硝基四NBT      5mg
NADH              4mg
新鲜配制,用前过滤。
染色
1、冰冻切片吹风筒冷风吹干;
2、
37℃ 孵育30分钟;
3、60%酒精洗两次;
4、水洗,过去离子水;
5、甘油明胶封片。
结果

肌纤维类型

颜色

 
注意制片放置一段时间会褪色,必
时要及时摄影保存。
六、改良
Gomoris 三色染色
试剂配制
变色酸
2R     0.6g
固绿 FCF     0.3g
磷钨酸       0.6g
双蒸水       100ml
4保存,一个月内使用。
染色步骤:
1、  Harriss苏木素染3分钟
2、  水洗,过去离子水;
3、  Gomoris染液室温1.5小时;
4、  分化,用0.2%乙酸快洗两次;
5、  稍水洗,过去离子水;
6、  常规脱水封固。
结果:
细胞核深红色,胞浆蓝绿色。线粒体过多聚集时染成深红色。深红色聚在胞浆周边,称破碎红纤维,见于线粒体肌病。

改良Gomori 三色染色:细胞核深红色,胞浆蓝绿色
七、免疫组化染色:
1.
冰冻切片
2. Envision二步法
3.
第一抗体为抗肌萎缩蛋白Dystrophin
4. 阳性反应部位为肌膜,呈连续线状。
肌动蛋白结合蛋白Dystrophin(抗肌萎缩蛋白)位于细胞质膜内表面,连接肌动蛋白丝和跨膜整合膜蛋白。编码Dystrophin的基因突变会导致进行性肌营养不良。

 

 

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