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病理HE制片技术的规范和质量控制


更新时间:2006-04-22 08:38:27 作者中山大学中山医学院病理学教研室 梁英杰


(三)

4.9 苏木精染液配制   配好苏木精染HE染色的关键。苏木精配制有多种配方,关键在于氧化。如加氧化汞作氧化剂时,要防止氧化过度,同时注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸钠作氧化剂时,就无需把苏木精液煮沸。要配制自然成熟的苏木精则不需加氧化剂,但要较长时间才能氧化成熟。不同苏木精染液的染色时间为520分钟,自然氧化成熟的苏木精液染色时间可以更长。

* 苏木精染液的配制方法:

(1)Harri’s苏木精

         苏木精                              1 g

         无水乙醇                          10 ml

         硫酸铝钾                           20 g

         蒸馏水                           200 ml

         氧化汞                            0.5 g

         冰醋酸                             8 ml

分别用无水乙醇溶解苏木精,蒸馏水加热溶解硫酸铝钾,然后两液混合并煮沸,加入氧化汞,继续加热和搅拌至溶液为深紫色,立即用冰水冷却,恢复至室温后过滤备用。

2)改良Lillie-Mayer’s苏木精

          苏木精                            2.5 g

          无水乙醇                         20 ml

          硫酸铝钾                           5 g

          蒸馏水                           330 ml

          碘酸钠                           250 mg

          甘油                             150 ml

冰醋酸                            10 ml

   分别用无水乙醇溶解苏木素,蒸馏水溶解硫酸铝钾,然后两液混合后,依次加入碘酸钠、甘油和冰醋酸。

   (3)Mayer’s苏木精

          苏木精                           100 mg

          蒸馏水                            100 ml

          碘酸钠                            20 mg

          硫酸铝铵                            5 g

柠檬酸                           100 mg

水合氯醛                            5 g

用蒸馏水溶解苏木精后,依次加入碘酸钠、硫酸铝铵、柠檬酸和水合氯醛,过滤后存于4℃冰箱备用。

4.10  分化  分化是把过染的细胞核部分和不应着苏木精的细胞浆等组织成分脱色,从而使着染的细胞核与细胞浆及细胞周围的组织成分对比清晰。分化时间的长短视组织的性质,切片的厚薄,苏木精染色的深浅和分化液的新旧来决定,一般是25秒钟,若切片不分化或分化不足,组织不仅着染细胞核,也着染细胞浆等其他成分,使组织结构对比不清晰;若分化过度,细胞核过淡或褪色。用Mayer’s苏木精染色,通常都不用分化。盐酸乙醇分化后,一般需流水冲冼,避免切片留有盐酸,使细胞核褪色。另一方面苏木精经酸后要经流水冲洗来促兰。流水冲冼一般需1530分钟。如要缩短时间,可用碱性的促兰液来代替流水冲洗。

* 盐酸-乙醇分化液的配制

  浓盐酸                                1ml

   70%乙醇                              99ml

* 促蓝液的配制

(1)Scott促蓝液

重碳酸钠                           0.35 g

硫酸镁                                2g

蒸馏水                             100ml

麝香草酚少量

(2)氢氧化氨水溶液

浓氨水                           0.1~1ml

蒸馏水                              99ml

(3)碳酸锂水溶液

碳酸锂                                 1 g

蒸馏水                               100ml

411  曙红染液配制   曙红主要是染细胞浆肌纤维、胶原纤维和红细胞等作为对比染色,染色适中与细胞核相衬,红兰对比鲜明。 在曙红水溶液中加冰醋酸可起促染作用, 但加酸太多,可使曙红沉淀而慢慢失效。

* 曙红液的配制

(1)0.25~0.5%曙红Y水溶液。

曙红Y                          0.25~0.5g

蒸馏水                              100ml

冰醋酸                                1滴

(2)0.5曙红Y—氯化钙水溶液   

          曙红Y                                 0.5g

蒸馏水                               100ml

无水氯化钙                             0.5g

(3)0.25~0.5%曙红Y乙醇溶液。

曙红Y                             0.25~0.5g

80%乙醇                              100ml

*  常规HE染色步骤:

(1)二甲苯(Ⅰ)                           5-10 min

(2) 二甲苯(Ⅱ)                           5-10 min

(3)  95%乙醇(Ⅰ)                          1-3 min

(4)95%乙醇(Ⅱ)                           1-3 min

(5)80%乙醇                                  1 min

(6)蒸馏水                                    1 min

(7)苏木精液染色                            5-15 min

(8 ) 流水稍洗去苏木精液                         1-3 s

(9) 1%盐酸乙醇                                 1-3 s

(10) 稍水洗                                   10-30 s

(11)促蓝液返蓝                               10-30 s

(12) 流水冲洗                               10-15 min

(13)蒸馏水过洗                                 1-2 s

(14) 0.5%曙红液染色                           1-3 min

(15) 蒸馏水稍洗                                  1-2 s

(16) 80%乙醇稍洗                                1-2 s

(17) 95%乙醇(Ⅰ)                              2-3 s

(18) 95%乙醇(Ⅱ)                              3-5 s

(19) 无水乙醇                                5-10 min

(20) 石炭酸二甲苯                            5-10 min

(21) 二甲苯(Ⅰ)                               2 min

(22) 二甲苯(Ⅱ)                               2 min

(23) 二甲苯(Ⅲ)                               2 min

(24) 中性树胶封固

注:①第(10)、(11)步可省去,(12)步冲水时间需延长至20-30min。

②第(20)步如果不用石炭酸二甲苯,可改用无水乙醇。

* 冷冻切片HE染色步骤:

(1)冰冻切片固定                    10~30 s

(2)稍水洗                            1~2 s

(3)苏木精液染色(60℃)              30~60 s

(4)流水洗去苏木精液                 5~10 s

(5)1%盐酸乙醇                       1~3 s

(6)稍水洗                            1~2 s

(7)促蓝液返蓝                       5~10 s

(8)流水冲洗                        15~30 s

(9)0.5%曙红液染色                  30~60 s

(10)蒸馏水稍洗                        1~2 s

(11)80%乙醇                          1~2 s

(12)95%乙醇                          1~2 s

(13)无水乙醇                          1~2 s

(14)石炭酸二甲苯                      2~3 s

(15)二甲苯(Ⅰ)                      2~3 s

(16)二甲苯(Ⅱ)                      2~3 s

(17)中性树胶封固。

    注:第(14)步如果不用石炭酸二甲苯,可改用无水乙醇。

染色结果:细胞核蓝色、胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。

412  切片脱水透明   切片经HE染色后要彻底脱水透明,才能用中性树胶封盖,。如果脱水不彻底,封片后呈白色雾状,镜下观察模糊不清,且容易褪色。切片1-2级无水乙醇脱水,也可使用石碳酸二甲苯进行脱水。石碳酸有较强脱水能力,但长时间可使切片脱色,因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去。

* 石炭酸--二甲苯混合液的配制

石炭酸(加热至约60℃)                    1

  二甲苯                                    3

413  封片   切片染色后封片常用中性树胶,酸性的树胶可使胞核褪色,如树胶放置时间过长,因氧化而变酸。中性树胶可用二甲苯稀释。树胶过浓,封片时容易导致气泡;过稀,封片时易使胶外溢,影响美观,也会出现由于二甲苯挥发后缺胶的现象。

414   在整个染色过程中不让切片干涸:切片完全干涸,会使组织收缩和出现裂痕即出现所谓龟裂现象。也会使部分细胞核透明不良,看起来像黑色的细胞核,即形成“黑核”。

完成染色后,每张片子要在显微镜下观察,检查制片的质量和组织片是否与送检标本相符,记录每个病例制片的数量,确保在整个制片过程中没有发生差错。

5   HE制片的质量要求

HE制片是病理医生用作病理诊断的基本和重要的依据一,病理技术员的责任就是为病理医生提供高质量的HE制片。一张高质量的HE制片要做到:(1)切片完整、贴片恰当。(2)切片较薄和均匀。(3)无皱折。(4)无刀痕。(5)染色清晰、核浆分明、透明度好。(6)无固缩、龟裂、污染。(7)封胶适当、玻片清洁。(8)标签号码清楚,字体端正。


(-待 续-)

 

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