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创新技术在常规制片实验室的应用


更新时间:2006-04-22 08:38:30     广东省人民医院病理科  张 威

 

现代病理实验室的运行与建立应是设备精良、技术先进、环境环保,同时具备多种特殊功能和特点:(1)努力缩短样本的制备周期时间,争取最短时间(1-2天)内做出病理诊断报告,包括免疫组织化学和电镜诊断。(2)加强分子生物学分析;分子生物学的研究将在未来的诊断分析中起着极其重要的作用,而DNA和RNA的保存和抽提是关键。希望有一种新型组织固定剂,代替目前的甲醛固定剂。(3)建立环保型的病理实验室,无毒性气体弥漫的工作环境,希望做到不用甲醛固定组织,不用二甲苯作透明剂。(4)缩短取材时间,丰富报告内容;利用先进技术保存大体标本数码图像,并将大体标本图像增加到报告中,以满足外科医生和临床医生的需要。(5)传递信息快速;在短短几秒钟时间内通过电子邮件发送病理图文报告。

针对上述功能要求,问题的焦点是集中在缩短送检标本的制备时间,一般的情况下,阅片所需时间占整个标本制备和诊断总时间的比例非常小,据有关资料统计,最顺利的情况是0.1%,最棘手的情况也仅有1.7%图(1),而标本制备各占1048min和1715min(17/小时/28/小时),这种现状应当有所改变。减少标本制作时间,规范标本的制作程序以及保证标本制作质量,并给阅片中较为充裕的时间,才是科学的运行模式。

一、RHS自控微波技术在HE制片中的应用

   2003-2004我科引用RHS自控微波新技术,该技术的特点是通过电脑微积分集合软件(PID)有效在控制微波发射功率,利用红外线感应器监控温度,采用标准化的标本制作窗口配合独特的JFC组织脱水液或选用国产溶液异丙醇代替JFC。在程序上做脱水、透明同步进行。我们对各种类型的组织共6015块组织进行了创新条件和简化程序制作方法上的试验,并将新方法制作的组织蜡块及切片、染色结果与传统的常规石蜡制作方法作比较。

(一)材料与方法

1.材料:(1)仪器: 意大利Milestone RHS自控微波组织处理仪一套(微波仪、触摸式控制终端、真空软干燥及磁力搅拌、红外线控制器、组织处理容器瓶等器材一批). (2)试剂: JFC溶液(由乙醇、异丙醇和长链碳氢化合物组成的化学溶剂)、异丙醇溶液、无水乙醇溶液。(3)临床送检组织1848例,分为三组,第一组658例,第二组574例,第三组616例,每组标本均含有36种不同类型的组织,包括:乳腺、淋巴结、子宫肌、甲状腺、胃肠、肝、脑、肺、卵巢、胆囊、骨髓等组织。按组织大小形态分为三种规格:小块组织(2x2x2 mm),中块组织(10x5x3 mm),大块组织(15x10x3 mm)。

2.方法:(1)医检组织取材后,三组标本分别按不同程序进行脱水处理。第一组选用JFC溶液对组织进行脱水、透明、浸蜡。第二组选用无水乙醇+异丙醇溶液对组织进行脱水、透明、浸蜡。第三组选用常规脱水、透明、浸蜡制片方法(见表一、二)。(2)将组织块放入选定(30/110块)的组织仓架内,在玻璃容器内加入1200ml的脱水剂(JFC或异丙醇),启动触摸式控制终端,选择试验项目和预设程序,确定启动程序后屏幕显示运行曲线,曲线表示各个阶段组织脱水所需的时间、温度、压力等。(3)完成组织制片程序需要4个步骤,以小标本为例。第一步:组织固定(4%中性福尔马林)20 min。第二步:JFC或异丙醇溶液同步脱水透明,约需要18 min。 第三步:组织在真空下进行软干燥1.5 min。第四步:组织在真空100-500mbar压力下浸蜡10min。三组组织制成蜡块及染片后设定蜡块、切片、染色效果的评判标准,对其结果进行统计对照比较。

表一(JFC溶液)(30位组织仓)

规格

总时间

固定

JFC

真空 浸蜡

   2×2×2mm

50 min 20 min
50℃

18.5 min/55-68℃

1.5min,70℃,500mbar

10min,66-70℃
400-100mbar

 10×5×3mm

 84 min

25 min
50℃

35 min/63-68℃

1.5min,70℃,500mbar

22.5 min,70-66℃
500-100mbar

15×10×3mm 150 min

30 min
50℃

84 min/63-68℃

1.5min,70℃,500mbar

33.5 min,70-66℃
500-100mbar

三种规格混合

   14 h            常规脱水机


表二(无水乙醇+异丙醇)(30位组织仓)

   规格

总时间

固定

无水乙醇

异丙醇

真空

浸蜡

2 × 2×2 mm

63min 20min
50℃
13min
50℃
18min
55-68℃
1.5min,70℃,
500mbar
10.5min,66-70℃
400-100mbar

10 ×5×3mm

102min 25min
50℃
18min
50℃
35min
63-68℃
1.5min,70℃,
500mbar
22.5min,70-66℃
500-100mbar

15×10×3mm

150min 30min
50℃
20min
50℃
65min
63-68℃
1.5min,70℃,
500mbar
33.5min,70-66℃
500-100mbar

三种规格混合

 14 h            常规脱水机

 

(一)结果与效应

第一组658例标本采用专用JFC溶液作为组织的脱水、透明试剂。试验条件和程序见表一,蜡块制作合格率为97.8%见表三。第二组574例标本选用国产试剂无水乙醇+异丙醇作为组织的脱水透明试剂。试验条件和程序见表二,蜡块制作合格率为96.5%见表三。第三组616例标本为传统常规方法,使用乙醇和二甲苯进行脱水透明,蜡块制作合格率为98.7%见表三。以上三项结果统计见表三。

表三:    蜡 块 质 量 指 数 表

指数 分组

组织偏硬

组织偏软

脱水透明不全

浸蜡不充分

合格率

第一组 658例

6

4

4

2

97.6%

第二组 574例

8

4

8

4

96.5%

第三组 616例

2

3

1

2

98.7%

镜下观察:切片的完整性,染色的效果和组织层次结构以及细胞形态的保存情况分别作了比较和总结.见表四.

表四:     切 片 质 量 指 数 表

指数分组

切片完整性

染色效果

组织结构 细胞形态

第一组658例

完整,较薄,无皱折,
龟裂
厚度3-4μm

核浆对比鲜艳透明度良好

层次清晰,无挤压 细胞形态无破碎,
无固缩,无肿胀,无破裂

第二组574例

完整,较薄,少数皱折,
龟裂
厚度3-4μm

核浆对比鲜艳透明度良好

纤维脂质少数挤压,层次结构正常 细胞形态无破碎,
无固缩,无肿胀,无破裂

第三组616例

完整,较薄,无皱折,
龟裂
厚度3-4μm

核浆对比清楚透明度良好

结构完整,无挤压 细胞形态无破碎,
无固缩,无肿胀,无破裂

以上三组的比较无论是切片的厚薄、完整性和组织的染色效果、组织的层次结构以及细胞的形态保持都无较大区别。从进口试剂与国产试剂,新方法与常规方法的比较, 无论是实验结果、资料统计和镜下观察,三组之间的合格率相差在一个百分点左右。

 ( 三 )讨论与评价

    RHS微波组织快速处理仪是以创新技术为基础,通过微电脑积分软件解决微波的自控发射功率,以及红外线有效精确地控制温度, 真正从技术上解决了以前家用微波炉不能解决的温度恒定问题, 给组织病理学制作切片、染色带来了稳定性高、重复性好的仪器设备。建立了多种标准化程序,采用多种标准化容器。其最大特点是该仪器具有现代工艺技术的真空软干燥控制功能,由于这功能的应用把组织标本处理技术推向新的高度,具有与常规方法无可比拟的优越性[1]。

    用自控微波技术进行组织固定、脱水、透明、浸蜡全过程所需时间仅是常规制片方法的十分之一至二十分之一。按组织大小而定,小组织(2x2x2mm)的固定、脱水、透明、浸蜡只需50 min。如果固定充分的组织,全过程只需30 min,相当于传统常规方法的二十分之一时间。即使是大组织(15x10x3mm)全过程只需2.5h,相当于常规制片方法14h的六分之一。时间效率完全体现了价值观,在组织蜡块的制作程序上有新的突破,打破了过去病理制片100多年来的传统方法。采用高效率的生化合成试剂JFC脱水溶剂或无水乙醇+异丙醇脱水液,使组织达到同步脱水和透明。摆脱了组织脱水必须从低浓度到高浓度梯度式的长时间脱水方法。完全省了二甲苯透明这一步骤, 避免了二甲苯对工作人员的损害和对环境的污染,这是病理制片技术的新突破。该技术的基本脱水原理:JFC或异丙醇溶液在微波作用下,极性分子和离子快速震动,并在55℃至68℃的温度中进行分子交换。以JFC或异丙醇替换组织中的水分和脂质,在真空(500mbar)软干燥作用下,去掉残余的JFC或异丙醇溶液,从而达到脱水、透明的目的[1,2]。并通过Weflon微波吸收器以及试剂磁性搅拌,并在100mbar高度真空作用下形成气化抽提过程。使残余的溶液(JFC或异丙醇)在石蜡中形成小气泡从组织中溢出,从而达到极短时间(10-33 min)内完成组织浸蜡的目的。比原常规方法浸蜡2-3h缩短了10-15倍的时间。

    JFC溶液是生产厂家的专利产品,它的化学结构分子式和合成成分目前在专利保护阶段,只知道是由一定比例的乙醇和异丙醇和一种长链碳氢化合物组成的化学溶剂,是易燃的碳氢化合物, 有轻微的刺激气味,沸点为78.5℃,熔点为-114.1℃,在常态下可与醇类和水相溶。当人体过度吸入或长时间接触后,可能会引起咳嗽或对皮肤有刺激作用。应保持试剂配置和存放场所通风良好。根据IARCⅢ级分类法,该试剂不属于致癌分类法的定义范围。JFC溶液在微波辅助作用下可用分子极化解释,按常规组织制片规律而言,要获得理想的抽提效果,溶液的极性就必须与待抽提的杂质(指水和脂肪)相似。组织中的脂肪主要有两种:甘油(由长链脂肪酸脂化而成)和磷脂。前者中度极性,后者则具有很高极性。JFC中的异丙醇、乙醇和第三种成分-长链碳氢化合物对极性和非极性脂肪链有高效、良好的抽提效果。在微波照射下,组织中的脂肪及水分子和JFC中的乙醇以及异丙醇等吸收能量,帮助组织中的这些杂质(指水和脂肪)转移到JFC溶液中而JFC中的乙醇和异丙醇等进入组织中。以上的论述分析有助于证明组织同步脱水、透明,一次到位的理论概念。

在实验组织块中乳腺纤维组织和肠类、卵巢黏液及脑组织就占有组织块总数的18%。而蜡块的制作和组织切片总体满意,只有6个蜡块出现单边轻度发白偏软,但没有造成切片困难和染色不佳现象。在镜下观察,组织结构层次清晰,表层、肌层、黏膜层保存良好,细胞核浆对比清楚,淋巴球能显示染色质的颗粒状结构。用乙醇+JFC+石蜡制片方法适用于部分固定或不确定是否经过整夜充分固定的组织,尤其适用于高脂组织处理,如乳腺和脑组织等。利用乙醇+异丙醇代替JFC溶液进行组织脱水、透明,同样能达到组织完全脱水、透明和均匀浸蜡的效果[2,4]。从实验第二组使用异丙醇作为脱水剂的组织蜡块资料统计显示,这种方法较为适合于小到中等的活检标本,或是含脂量较低的组织,如肝、胃黏膜、鼻咽黏膜、扁桃体等。组织脱水透明、浸蜡效果良好,包埋蜡块切面平整光滑。其中有6例组织块脱水、浸蜡有不足现象,经检查发现组织卵巢黏液过多,部分淋巴结包膜只是单面切开,造成溶液和石蜡浸透困难,与脱水剂的性能和使用没有关联。根据作者的经验,JFC或异丙醇可反复使用4次左右,要结合组织数量来选定仓位和溶液的比例,30个组织块需要1200ml溶液,110个组织块需要2500ml溶液。另有2例单纯脂肪瘤没经脱脂剂处理就直接进入JFC和异丙醇各程序制片,结果均告失败,蜡块明显浸蜡不足,不能切片。

常规切片方法与RHS制片方法在制作程序和处理工艺上有明显区别,但在蜡块制作效果上没有明显的差距,在组织块的质感上RHS方法制作的组织块包埋时感觉部分偏硬,切片时稍有同感。特别是子宫肌、淋巴结等组织。这大概与温度条件的调节有关,如时间的长短、温度的高低以及脱水透明剂(JFC、异丙醇)的使用次数或是真空负压力的调节都会直接影响组织的偏硬或偏软。但在镜下HE染色未能看到组织结构不良和细胞形态有特殊的改变,核浆对比分明,间质和胶原纤维与肌原纤维伊红染色深浅区分明显。

缩短制片时间,简化制作程序,符合制片要求,是RHS自控微波技术的新特点。本文通过多种方法和较大组织范围的试验和比较,认为该技术可以应用于病理组织常规制片。所制成蜡块的组织除了能保持原有的组织结构和形态外, 也和常规方法一样能保存组织细胞的各种成分,对组织的抗原也能很好地保存,可用于特殊染色和免疫组化染色。富有巨大的技术潜力和工作效率,值得推广使用。

二、利用多功能全自动脱水机对小活检标本的快速处理(1:58 min)

全自动密封式多功能脱水机,设有抽真空、调压力、调温度、调搅拌等多种功能,可以用作小标本的组织快速脱水制作处理,我科一年多来共处理了400多例小标本,标本类型有(胃粘膜、鼻咽粘膜、膜胸膜、颈宫组织、骨髓、皮肤等)。组织大小直经1~3㎜,能够在2小时左右完成对组织脱水、透明、浸蜡程序。组织蜡块透明,脱水浸蜡彻底,符合切片质量要求。镜下观察组织结构、细胞形态保持完整,未出现细胞固缩、胞核空洞现像。现将技术条件设定如下:

1.shan dun全自动脱水小标本程序设定小标本(胃黏膜 穿刺类)程序:常规取材后进入(1)80%酒精  8min  (搅拌真空 330C);(2)90%酒精 8min  (搅拌 真空、 330C); (3)95%酒精 2次  8min/次 (搅拌真空 33 0C);(4)无水酒精 2次  8min/次(搅拌真空 330C);(5)二甲苯 3次 8min/次  (真空 33 0C);(6)54-56 0C软石蜡1次20min/次 (真空 60 0C) ;(7)54-56 0C软石蜡2次8min/次 (真空 60 0C)。全程1:58 min。

2.结果:组织块柔韧适中,切片3µ可连续切片,HE染色胞核、胞浆对比清晰。

三、HE制片中性缓冲福尔马林固定组织的重要性

甲醛固定过程中,PH值的影响十分明显,在酸性环境下,重要的胺基(-NN2),靶基因俘获氢离子(-NH3)后不能与水合甲醛[CH2(OH2)]发生反应。同样,羧基(C00-)铁电荷(-C00H)而影响蛋白质结构。乙醇的羧基(-OH),包括丝氨酸和苏氨酸。在酸性环境下也很少与水合甲醛发生反应。由于主要的亚甲基紫联发生的赖氨酸以及侧链的游离胺基,因此在呈弱酸性、非缓冲的甲醛固定液中交联反应将会明显减少。PH值低于5.7就可以形成色素,PH值低于3~5的范围色素不断形成。所以组织的固定首先应是4%的中性甲醛磷酸缓冲液。

 其配方:

甲醛                                        1000ml

自来水                                      9000ml

磷酸二氢钠                                  2.7g

磷酸氢二钠                                  36.5g

氯化钠                                      76g

PH值:     7.0-7.2(稳定一个月时间)

四、低浓度甲醛固定液对免疫组化、原位杂交、DNA保存的影响

1.低浓度甲醛固定液用于免疫组化染色

•1990年,Kok和Boon提出0.5%--2%甲醛可以使组织有限交联状态取得平衡。HE染色,免疫组化染色效果良好。

•1998年,login报道采用稀释2 %福尔马林, 微波方法固定标本免疫组化标记效果极佳。此种固定方法不需要做抗原修复。

2.低浓度甲醛固定液用于原位杂交

Murotani等(1996年)报道了可将微波辅助固定方法,用于原位杂交。

在其结直肠癌基因的表达研究中,用微波处理的组织中成功检测到了:Ha-ras mRNA, Ki-ras  mRNA和c-myc mRNA。

固定液的组成包括:2%甲醛, 0.05% 戍二醛, 0.05M PBS和0.025%氯化钙,  PH值为7.35。

3.甲醛固定液对DNA保存的影响

1999年Williams和2002年Srinivasan提出甲醛液导至DNA及RNA发生修饰,主要取决于固定剂的浓度、PH值和温度。

固定时间越长,DNA链的长度越短,相应的DNA分子量也变小。

Koshiba等指出室温下福尔马林固定可导致DNA降解,而4℃福尔马林条件下则不发生DNA降解。

五、Lillis Mayera苏木素在HE 常规染色中的应用

1.优点所见:

   1.沉淀现象减少,使用时不必过滤,用于HE染色,细胞学涂片等。

   2.避免过度氧化,清除氧化金属膜,对组织和细胞着色清晰。

   3.着色能力持久,染色速度快,能适应退行性和增行性染色。

2.苏木素氧化与配方的组合:

Lillie-Mayer氏苏木素之所能达到沉淀少,降低过度氧化,增加着染力效果,是与染液所选择的氧化剂以及配方的合理组成有密切的关系,氧化决定了苏木红在染液中的有效分子的数量以及着染能力,而氧化剂的选择是苏木素氧化反应是否完全(充分)的先决条件。

Lillie-Maye氏苏木素和Hannis氏苏木素分别选择碘酸钠和黄色氧化汞作为各自的氧化剂,虽然碘酸钠和黄色氧化汞都是化学氧化剂,但是两种氧化剂的理化性状有较大的区别,主要表现如下三方面:

1. 氧化强度不同碘酸钠在氧化还原时,它们电极电位所产生的电对值+1.2伏特,黄色氧化汞的电对值+0.85伏特,两者对比碘酸钠的电对值大于黄色氧化汞,根据化学氧化还原电极电位数据规律表明:氧化剂的电对值愈大,其氧化态愈容易获得电子,也就表明它的氧化能力愈强。由此可见碘酸钠的氧化能力比黄色氧化汞要强百分之四十以上,从而提高了苏木素的成熟程度。
   2. 理化性状不同碘酸钠是溶于水的氧化剂,黄色氧化汞则不溶于水和醇,所以,用碘酸钠作为水溶性苏木素的氧化剂是符合理化反应规律的。因为碘酸钠在苏木素水溶液中分布是均匀的,分子之间的氧化交换自然也是呈均匀的反应,氧化作用也相对得到持续性的增,染液的染色效果得到明显的提高,而黄色氧化汞的水溶性差,在苏木素水溶液中氧化反应极不均匀,反应物所产生的有效成分少,苏木红的形成受到较大的限制,从而影响了染液的着染能力和持久性能。

3.软化剂:(甘油)起稳定助溶作用甘油(丙三醇)是一种软化剂的溶液,加进苏木素染液后。起到酸性助色基团作用,对溶液的复合物(色淀)的溶解性得到软化性的加强,苏木素染液处于稳定状态,减少了过量氧化和沉淀现象,从而,促进了苏木素与媒染剂结合,再与细胞核结合发挥了染色作用,使细胞核着色均匀细致,染色质结构清晰鲜艳。

3染液配方:

(1)苏木素染液

苏木素    5g     明矾   50g     碘酸纳    0.5g

蒸馏水   700 ml  甘油  300 ml   冰醋酸    20ml

(2)伊红染液

氯化钙   1g      伊红丫 1g      蒸留水   100 ml

六、全自动染色机对盐酸酒精分化剂浓度的选择

HE染色中选用盐酸酒精作为组织细胞过染后的分化剂是经典方法;浓度通常选择0.5-1%之间,过去手工操作染色,大部分选择1%的浓,使用Shan dun全自动染色机,我们发现程序设定的最短时间可设为1秒,但是实际的工作时间却是5秒钟。如果采用Lillis Meyara苏木素染液染色15分钟,在1%的盐酸酒精中分化5秒钟后,细胞核着色偏浅,细胞与胞浆及间质对比暗淡。特别是小组织的胃粘膜、皮肤、鼻咽粘膜等。影响镜下细胞形态及细胞分化程度的判断,为了保证组织与细胞调色的准确性,故应改用0.5%低浓度含量的盐酸酒精分化剂,才能适应时间控制范畴。附染色程序表:

全自动染色机 苏木素—伊红染色程序设定


步骤      试剂               浓度(%)        时间(分)   
1     染色机 烤片      ( 温度65-78 0C)       8:00
2      二甲苯                 100              4:00
3      二甲苯                 100              3:00
4      二甲苯                 100              3:00
5     酒  精                  100             00:40
6     酒  精                   95             00:40                
7     酒  精                   95             00:40
8     酒  精                   80             00:40
9     酒  精                   60             00:40
10     自来水                                 00:40
11     蒸馏水                                 00:40
12     苏木素                                 15:00
13     自来水                                 00:40 
14     盐酸酒精                0.5            00:01   
15     自来水                                 00:40
16     碳酸锂                                 00:30
17     自来水                                 15:00
18     水溶性伊红               1             01:00
19     自来水                                 00:25
20     酒  精                  60             00:15
21     酒  精                  80             00:15
22     酒  精                  95             00:15
23     酒  精                  95             00:15
24     酒  精                 100             00:15
25     酒  精                 100             00:15
26     酒  精                 100             00:15
27     二甲苯                 100             00:20
28     二甲苯                 100             00:20
29     二甲苯                 100             00:20

 

 

 

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