当前位置:病理技术组 > 如何制作好活检大小标本
 

如何制作好活检大小标本


作者:南方医科大学病理教研室,南方医院病理科  蔡俊杰   更新时间:2006-04-22 08:38:45  

 

至今为止,国际上的切片方法有三种即石蜡切片、冰冻切片和火棉胶切片。作为医院病理科,主要是如何制作好常规石蜡切片。医院病理科每天的检查标本五花八门,种类繁多,大小不一,小的如针头大小,大的有几十斤。相差如此巨大的标本,如何才能将它们制作好,根据我们的制作经验 ,谈一谈我们的做法, 以供参考。

 一、如有可能大小标本要分开来制作

虽然这种提法暂时还不大现实,据了解除个别单位外,大 多数病理科,都还是只有一台脱水机,手工操作的除外,但是,为了制作好切片,提高切片的质量,有必要把他给提出来,让同行们一道讨论,有利于共同提高。

(一)、小标本的制作:目前,小组织活检标本的有胃肠粘膜、肾脏 穿刺、肝脏穿刺,肺支气 管 镜、复垦刮宫和 鼻咽粘膜活检等。这些组织为了赶进度,只能跟大组织一起进入自动脱水机脱水程序。由于 组织 较小,他们经受了不该经受的待遇,过 度的脱水,过度的透明和过度的浸 蜡,往往这些组织制作 起来需要费点力气,切片时容易脆,連 续切片时切片不好展开,容易出现皱折等,另者鼻咽粘膜活检还可出现染色不好的现象,如何解决上述的问题呢 。我们的作法是:

1、固定液的量要冲分。据了解如鼻咽部粘膜活检,所用装标本的容器多用青霉素小瓶,瓶中固定液的量极少,当将组织放入固定时,固定液没能充分的 将组织浸没,此其一,其二是由于固定液量少,含有大量粘液样的组织将固定液稀释,降低了固定液的浓度,达不到固定的效果。组织固定不好,核的染色肯定不好,要改变这种现象,就必须改变固定液的量。

2、对于多块小组织,应将其埋藏在一水平面上。多块的组织如胃肠粘膜活检和刮宫活检,多块 组织取于不同的部位,反映着各个部位的病变,如果没有埋 藏于同一水平面上,组织块深浅不一,切片时就很难切到每一块组织,有时还会漏切,造成事故。                         

 3、要保证石蜡的硬度和纯度。石蜡是一种碳氢化合物,由矿物油分裂产生,它的性质是相当的不同,熔点在45-62 C之间,熔点越高,硬度越 硬,如果含有杂质和纯度不高,就很难切出佳片。小组织由于几个过度,组织较硬,应用的石蜡也要较硬,否则组织硬石蜡软是切不出好片来的,切出来的切片也较难展平,容易产生皱折。另者,包埋组织块的石蜡纯度一定要纯,不能含有二甲苯,如果含有二甲苯,将会降低石蜡的硬度,裱片时,石蜡将熔解于水并向四边扩散。常规应用的石蜡熔点为60C 左右,它能支撑起3-5um的切片,如果要求厚度在1-2  cm, 就必须添加一 些蜂蜡,以增加石蜡的硬度。

4、蜡块要在切片前 存放在冰格内冰冻起来,保证组织和蜡在同一温度,这样有利于切片。如果蜡和组织不在同一温度,由于组织的几个过渡,组织硬,蜡软,就很难切出好的切片来,切片时通常不要取出太多冰冻好的蜡块,否则室温可使蜡软下来,尤其是在夏天,另外切片时,切片刀和蜡块的磨檫产热,也会导致蜡块软化,切片时切片积压在一起,不容易展开,不利于切片。

5、在一张载玻片上要多捞几张切片。小块组织,可看面积不多,切片时尽量多裱些切片,以增加多些看店,增加不同层次组织变化的场面,以利于对疾病作出判断。

6、组织固定要充分。有人认为组织这么小,随便都能将其固定好,其实不然,有人认为,如鼻咽部的粘膜组织,固定的时间在4-6小时,因为鼻咽部粘膜组织虽然小,但 却含有大量的淋巴细胞,固定液和组织细胞的反应是需要时间的,固定液与组织中的各物质反应是很复杂的:与蛋白质和肽类的反应,甲醛与组织蛋白类的反应是多样而复杂的,因为它能和多种不同的功能基团结合,在多数情况 下在其间形成桥键。甲醛在相邻的蛋白质键间形成桥键的作用,是由于它是一个聚合固定剂。据 French 和 Edsall (1965),最常遇到的甲醛反应,就是加到一个含反应性氢原子的化合物中,形成一个羟甲基化合物*;甲醛有效固定作用的另一要点是在蛋白质末端基团间形成交联链*。这些组织中的物质与固定液间的反应是需要时间的,因此,要让组织充分固定好才能织和切片。 

(二)、大标本的制作:大标本有子宫肌瘤,胃肠道肿瘤,乳腺癌等。这些组织较为致密,脂肪含量多,制作起来比较麻烦,最常见的是组织取材较厚较大,组织在较短的时间内脱水不好,存 在许多问题, 必须认真给以对待,才能 制出 好片来。我们 认为必须按照下面几条原则来进行:

1、组织取材不能太厚太大,否则于固定、脱水、透明和浸蜡不利 。首先是固定,凡要固定的组织,都不要太大太厚,这是因为所有的固定液穿透力不够强,浸透力不够快的缘故,如果组织太厚,在没有得到完全固定的时候就进入下 一 个程序,势必造成核的染色不好;其次是组织脱水,组织脱水的干净彻底 与否是制好切片的关键。在 操做 过程中,人们把含于组织内或细胞内的水分用脱水剂把其置换出来的过程称为组织脱水。不管是正常的组织,还是有病变的组织,都含有不同程度量的水分。据测定,人体的物质组成约含水55~67%,蛋白质15~18%,脂类10~15%,无机盐3~4%及糖类1~2%[14]。如果不把这些水分脱去,石蜡切片将无法进行,因为石蜡和水不能混合在一起,所以除去组织中的水分成为制片中的关键,用什么物质才能担当起这个重任呢,至今为止,国内所用另的都是酒精。因它不管在什么样比例的情况下都能和水混合,所以它可以慢慢地将水从组织中置换出来。酒精脱水力强,对组织又有硬化和易脆的不良影响。在使用时,通常是从低浓度至高浓度,浓度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%,组织经过这一系列处理后,基本可达到脱水的目的。2、对全脂肪组织和含大量脂肪组织的标本要进行脱脂处理。脂肪组织主要由大量群集的脂肪细胞构成,他分为两类,一 类 是黄色脂肪组织,主要分布在皮下、网膜和系膜等处;另一类为棕色脂肪,这一类成人较少,主要是第一类。活检见到的全脂肪组织 主要是脂肪瘤、系膜和乳腺组织,这类组织如果取材较厚,又未经过脱脂肪处理,其最后结果是不好的。经实验证明:少量的脂肪组织和含类脂类物的组织,常规脱水程序就可以将脱去,对于全脂肪组织,常规脱水程序仅能脱去70-80%,达不到要求,由 于全脂肪组织大部分为脂肪滴,仅有少量的胶原纤维、血管和神经,不足以支撑局面,因此切片时难以切成整片,脂肪滴就象是烂泥巴,挤 压在一起。在制作全脂肪组织时,在组织块还没有进入脱水程序前,就必须先对其进 行处理,具体做法是:将取好的组织块,放 入纯丙酮中处理两个小时,然后将组织块取出来,再同其他组织块一起进 入脱水程序,这样既不影响病理报告的及时发出,又能保证制片的质量。除此之外,还可将取好的组织块,放入大的烧杯内,加入纯丙酮,然后 放入微波炉内进行微波辅射20分钟后,再同其他组织块一起进入脱水程序。丙酮可反复使用,但要看处理的组织的数量,要保证丙酮的脱脂力。

3、要使用透明力 强的试剂。组织经过一系列酒精的处理后,虽然组织里所含有的水分已基本上被脱去,但是组织脱水时机里可残留着许多酒精,如果不将其去除掉,必然影响组织的进一步处理,酒精不能溶解石蜡,必须寻找一种既能与酒精混合,又能溶解石蜡的试剂,方能使石蜡浸入到组织中去,这类物质被称为透明剂。它们是二甲苯、苯、三氯甲烷(氯仿)、香柏油、苯酚、松节油和汽油等。虽然透明剂种类多,但根据性能及效果看,还是二甲苯为最好。他对组织作用的力度强,效果好,而且活检的制作时间短,不用强力试剂是不行的。

二甲苯是一种透明无色的液体,挥发性强,打开后即可闻其味道,能溶解石蜡,能溶于酒精及丙酮等,但不能溶于水,它是一种良好的透明剂,组织经充分脱水后放入该试剂,视组织的大小、种类的不同,确定不同的时间,便能达到透明目的。在一般的情况下,胃、肠粘膜透明时间5-10分钟,鼻咽部及排出物为15-20分钟左右,子宫肌瘤、平滑肌组织为60-120分钟。总之组织的透明,应视组织的大小而定,不能千篇一律,要经常观察组织的透明情况,组织一经透明,就必须从二甲苯中取出。因为二甲苯对组织的硬化程度特强,如果在其放置过长,就会引起组织的硬脆,难切片。如果组织在二甲苯放置到一定时间后,仍没有达到透明,组织块中间可出现粉白色的现象,这说明组织没有完全脱水,处理这种情况有两种方法,一是将其重新放入酒精脱水,然后再透明,这种方法处理的组织很硬,切片较难。另一种方法就是重取材。如果将没脱水好的组织继续做下去,切片将不完整。或者无法切片。当然这都在手工操作时才能做到。在 脱水机中只能按程序进行。 

二甲苯及苯类物质被认为是一种致癌性的物质,许多单位和个人都不敢用或尽量少用,或者在切片染色至酒精后,将切片吹干就进行封片,这种做法是非常糟糕的,以往切片的整个制作程序都强调不要使切片干涸,上述做法将会影响切片颜色的保存。

4、要深入了石蜡的性能和用途

组织浸蜡时,由于诱导剂(二甲苯)的作用,石蜡进入到组织的各个角落,并在各个角落中保存下来。当石蜡包埋后冷却时,这浸入到里面的石蜡便可起到支撑的作用,而且使组织不致于变形,塌陷等现象,使切片能完整的切出,便于镜下观察。这是石蜡切片的一个特殊功能,是其它切片代替不了的,

组织浸蜡据多次文献*报到必须换几次不同熔点的石蜡。石蜡有软蜡和硬蜡之分,软蜡的熔点有45°C、52~54°C。硬蜡的熔有56~58°C,58~60°C、60~62°C。浸蜡的顺序 是先软蜡,后硬蜡,浸蜡的时间根据组织不同而确定不同的时间。有的人指出组织浸蜡先放入二甲苯与石蜡等份混合的液体中浸渍然后再放入软蜡、硬蜡。根据使用经验我认为不必要这样做。因为组织经二甲苯或其它透明剂透明后,在组织进入石蜡时,自身还带着残存的透明液,如为手工操作,可将组织块控干,尽量减少残存液的存在,而自动脱水机则不然 , 经使用次数多次后,残存的透明剂可把石蜡稀释。因此机器程序处理的次数较多时,应注意换石蜡,以防组织浸蜡效果不好。

  石蜡是一种碳氢化合物,由矿物油的较高,适合于夏天切片的用蜡,熔点低的为软蜡,54°C以下的称为软蜡,这种适合于组织化学的切片用蜡。根据石蜡的特点,根据季节的不同,合理地使用不同熔点的石蜡,这是能否切好片,使切片产生带状的关键。

为了获得较好的连续切片,人们想出了许多种方法,对石蜡进行改造,使石蜡的硬度和柔软性更适合于佳片的切出,提出了许多种方法:

石蜡加热冷却法

刚购入的石蜡,不管是动植物切片石蜡也好,还是工业用蜡也好,都必须进行处理,方法是:将石蜡放于容器里,于电炉上加此时石蜡遇热熔解并发出哔哔吧吧的声音,这是石蜡中含有的杂质,遇热后分解所发出的声音,随着时间的延长,温度的升高,这种声音将逐渐减少,直至消失。此时可将盛装石蜡的容器浸入冷水中,石蜡凝结后,再继续加热,如此反复几次即熔化—冷却—熔化—冷却。这种处理方法,可增加石蜡的密度和可塑性,除去杂质。为达高质量的切片,这是必经之法。

增加和改善石蜡的韧性和粘度

这种方法则需要加入一些东西才能获得,如蜂蜡和硬脂肪,蜂蜡最高熔点可达70余度,增加它可增加石蜡的硬度。石蜡切片切4—5um,60°C左右的石蜡可支撑得起,如要切1~3um,其硬度则不够,因此,要制出较薄的切片,石蜡硬度一定要过关。

另外,增加石蜡的硬度还可以加入脂蜡酸、柏油、杨梅蜡等,虽然如此,石蜡经处理后,用时的颜色如肥皂一样为最好。

 二、切片的普通染色及其必须注意的问题

普通染色又称常规染色或HE(Haematoxylin and eosin)染色。它是病理技术中最常用的一种方法,通过它可以做出病理诊断和发现寻求别的辅助方法,以达到准确,完整的病理诊断。

(1)染色目的

病理学的所有切片,都必须通过一种以上的染料,通过各种不同的方法,将切片中各种不同的物质,在不同染液的作用下,将其显示出来,使之在光学显微镜下,能够完全的观看各种结构。例如,HE染色,好质量的切片可以清晰地显示出许多不同的结构,细胞核着蓝黑色,细胞浆着粉红色,软骨着蓝色等。清晰的结构为诊断提供可靠的依据,因此,染色技术也是病理技术中的重要组成部分,必须不断地总结,方能提高。如果染色不好,切片染色一团糟,红蓝不分,结构不清,层次不明,影响了镜下的观察,直接影响了临床诊断,染色结果的好坏直接关系到诊断的准确性。

(2)、染色时必须注意的问 题:

制作好一张病理组织切片,其要求是非常严格的,不但要进行标准化 操作,还要求切片能长期保存,对已 着染的 颜色,要保持其鲜艳性和不褪色,还要随时等待取出复诊和 会诊,满 足 一   些 科学 研究的需要和 质,料的积累,所有这些,其难度是很大的。为了达到上述的目的和要求,就必须在制片时严格遵守操作规程并不断总结 经验。根据我们的实验,1982年6月至今,已有23年,当 时制作的切片,切片除封固的中性树胶变为淡黄色外,切片的颜色还非常鲜艳,由此体会有几点:

1、不管是染色机还是手工染色,脱水剂酒 精要常更换,特别是无水酒精,要切保该试剂的 无水性。我省属南方地区,濒临海边,属于海洋气候,多雨天气时间较长,空气潮湿,尤其是在3月天,切片很容易带上水,而水是造成切片褪色的主原要因,因此,切片进入各级酒精后,就不要再让 切片干涸,切片干涸后就可带着空气之中的水分进入下一步,这样切片不但得不到透明,还会使切片模糊不清。

2、要提倡用石碳酸二甲苯的使用。因为石碳酸的吸水性强,应用它可提高切片的透明度。有人认为石碳酸是一种弱酸,用它可使切片褪色,但据我们的实验认为,石 碳酸是一 种弱酸, 它不会 造成切片的褪色,用它后只要用2-3 缸的二甲苯洗,就可将其洗去。     

3、切片封固时,不要让切片干涸,要保留有足够的二甲苯。二甲 苯不溶于水,切片保留有足够的二甲苯,使切片与空气隔绝,此时滴上中性树胶,胶就会沿着二甲苯弥漫开来,盖上盖玻片,这样切片就完全地与空气隔绝,达到理想的效果。

4、中性树胶要浓稀合适,不要含有过多的二甲苯,否则二甲苯一挥发,封固胶一收缩,切片便可出现一半切片封固不上的现象。

5、必须配置好苏木素和伊红染液。 

参考文献:

1、A.G.E.皮尔斯 著。马仲魁译。组织化学-理论和实用。卷一:制备与光学技术。人民卫生出版社。1985;88-90

2、赵甲治。生物学。北京师范大学继续教育学院-亚洲开放教育学院印刷。1981;1

3、R.D.Lillie.MD. Harolel M.Fullmer.D.D.S. Histopathologic Technic and Prac- tical Hitochemistry. Mcgraw-Hill Book Company.1976;55-57 

4.王伯潭,李玉松,黄高松,张远强主编。病理学技术。北京人民卫生出版社,2000;71。

 

 

精 彩 文 章 链 接