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应用冷冻切片和石蜡切片显示结核杆菌的研究
 


更新时间:2008-01-09 16:44:03 作者: 南方医科大学病理学教研室;南方医院病理科 蔡俊杰


一、检测结核(TB)杆菌存在的问题和难点。
    结核杆菌应用石蜡切片来显示,历来是病理技术中的一个难点,在所检测的常规活检病例中当发现有结核结节,有干酪样坏死的组织切片中,能够成功地找到结核杆菌是少之又少。这是因为结核杆菌它们常聚集在一起,存在于组织的某一个局限部位,而不是整个结核结节的各个部位。也就是说不是随便取一块组织就能够检测到结核杆菌,因此很多典型结核干酪样坏死的组织,所做结合杆菌染色,就是发现不了结核杆菌。根据卫生部疫情传染病的通告,我国结核病的发病有明显增多的苗头。更有甚者有报道认为:世界各地出现了一种令人不安的现象,即对治疗结核所用的一线和二线抗生素都具有抗药性的肺结核病例在增多。[1] 作为医务工作者,主要是怎么样才能够将结核杆菌清晰的,准确的给以显示出来,这是新情况所赋予的使命。为了能够准确的显示结核杆菌,增加诊断的准确性,为临床提供治疗方面可靠的依据,本研究应用两种切片,对结核杆菌的显示进行研究,现报告如下。

二、常用的检测方法 :
(1)方法:新鲜组织冷冻切片显示结核杆菌。
1. 恒冷箱冷冻切片厚5 um,附贴于硅化的载玻片上,
2. 即刻 固定于AAF固定液中30秒钟;
3. 自来水洗;
4. 浸入石炭酸酒精性品红染色液中在室温下染色60分钟;
5. 自来水洗;
6. 25%硫酸水溶液分化切片;
7. 自来水洗;
8. 20%硫酸水溶液分化切片;
9. 自来水洗;
10. 15%硫酸水溶液分化切片,在显微镜下观察,如果结核杆菌显色合适,即可终止分化,
11. 如果背景还有其它多余的红色,可用10%硫酸水溶液继续分化直至合适为止;
12. 用0.2%淡绿醋酸水溶液或明矾苏木素染液作对比染色,前者优于后者;
13. 自来水洗;
14. 风干切片;
15. 二甲苯透明,中性树胶封固。
(2)、方法:常规石蜡切片显示结核杆菌。
1、 石蜡切片厚5 um,附贴于硅化的载玻片上于650C恒温干燥箱中烘烤1-2 小时;
2、用汽油-松节油等分混合液脱蜡10分钟;
3、快速通过二甲苯洗去混合脱蜡液,快速经过各级酒精洗,
4、自来水洗;
5、浸入石炭酸酒精性品红染色液中在室温下染色60分钟;
6、 自来水洗;
7、 25%硫酸水溶液分化切片;
8、自来水洗;
9、 20%硫酸水溶液分化切片;
10、自来水洗;
11 、15%硫酸水溶液分化切片,在显微镜下观察,如果结核杆菌显色合适,即可终止分化,
12、如果背景还有其它多余的红色,可用10%硫酸水溶液继续分化直至合适为止;
13、用0.2%淡绿醋酸水溶液或明矾苏木素染液作对比染色,前者优于后者;
14、自来水洗;
15、风干切片;
16、二甲苯透明,中性树胶封固。

三、可获得的结果。
用新鲜组织冷冻切片显示的结核杆菌,在所试验的病例中,在一大片干酪样坏死的组织中,仅可见到一个局部的地方有结核杆菌的存在,结核杆菌聚居成团,呈细长条状,约4-6um长,两头尖细,被染为鲜红色,如用淡绿醋酸水溶液作对比染色,背景则全为绿色。如用明矾苏木素作对比染色,则细胞核可被染为灰蓝色 。应用常规石蜡切片显示结核杆菌,在所试验的病例中,在一大片干酪样坏死的组织中,仅可见到一个局部的地方有结核杆菌的存在,结核杆菌不是聚居成团,而是较均匀地分散在切片上,呈细长条状,约3- 4 um长,两头尖细,如用淡绿醋酸水溶液作对比染色,背景则全为绿色。如用明矾苏木素作对比染色,则细胞核可被染为灰蓝色。

四、需要检测的病例和检测时必须注意的问题
在临床活检中,在非肿瘤性肺疾病的切片中,有许多疾病都可不同程度的引起肺部的结节性病变,而这些病变都必须用特殊的染色方法来证实和排除。这些疾病包括弥漫性肺间质纤维化、脱屑性间质性肺炎、蜂窝肺、弥漫性肺泡损伤、外源性过敏性肺泡炎、肺嗜酸性细胞反应、阻塞性细支气管炎、嗜酸性肉芽肿、淋巴瘤样肉芽肿病、肺玻璃样变性肉芽肿和浆细胞肉芽肿[2]等。它们与肺结核的显微镜下也没有明显的区别。应当指出结核在显微镜并无特异性组织学改变籍以诊断。鉴定结核菌对诊断是必须的。[ 3,353 ]病理科在鉴别这方面的病例还是非常多的,如纤维支气管镜活检,手术外科切除肺标本,细针穿刺细胞学等等。对于此类标本,显微镜下有着许多不同的表达形式,如可见干酪样坏死区,可见抗酸杆菌。中心干酪性坏死周围可见厚层纤维组织壁,数目不等的朗汉斯巨细胞,上皮样组织细胞和淋巴细胞位于其中。可见纤维性胸膜增厚。[2,353] 在随机统计287例检测的结核病里中有肺结核63例,占22%,其中手术病例27例占肺结核中的42。8%,肺穿刺病例36例,占57。1%,淋巴结结核70例,占总数的24。3%。从随机统计中发现,病理科肺结核标本的来源,大约一半是手术标本,一半是穿刺标本。淋巴结结核占据着很大的比例,这说明人体的免疫系统在抵御微生物的攻击方面起到了至相关重要的作用,首当其冲。因而也提示了在检查淋巴结时有必要做相应的结核杆菌检查。
应用石蜡切片来显示结核杆菌历来都是病理技术工作中的难题之一,由于TB菌体含有脂类等物质,尤其是脂类物质,随着组织常规制作,菌体上的脂类物质,被脱水剂溶去了大半,剩下的只能是菌体的骨架,这就是为什么TB杆菌显示时显得很微细之故。在我们的实验中,有很多病例是完整一个结核结节但经过染色后,仅有在一个局部地方发现有结核杆菌,这就给我们提出一个问题,要显示结核杆菌,必须要取好材取准材和多取材,如果仅取到坏死组织,没有取到含有结核杆菌的组织,就是有天大的本事,也难把结核杆菌显示出来,也因此而使显示TB杆菌的技术难以完成,造成某些不足。随着科技的进步,设备的更新,技术的成熟,以往许多难以实现的东西,现在都可以应用自如。比如应用新鲜组织冷冻切片显示TB杆菌就是一个明显的例子。
TB杆菌菌体在新鲜的时候含有许多脂类物质,磷脂等,这些物质在常规的制片中,由于脱水剂的作用,大部分的物质都将被脱去,留下的仅是结核杆菌的骨架。因而显得菌体很纤细。以往由于各种条件的关系,很少能将新鲜组织中的新鲜的TB杆菌给以显示出来。仅能在培养基才能见到新鲜的结核杆菌。基于此 本研究采用新鲜组织的冷冻切片来显示结核杆菌,所显示的细菌个大体胖,跟其它的菌体还是有差别的。该菌体上的各种物质不受到破坏,基本完整地被保存下来,因而能完整地显示结核杆菌的全貌。
如何才能很好的将结核杆菌给予显示出来,经过反复的试验,认为有如下几点:
(1)、 :浸染切片的温度。浸染切片的温度一定要合适,为了能使染液能够更快更加大量的浸入菌体,原法对石蜡的切片提出了用加热的方法[ 4],我们经过反复的试验,认为在室温下也可以完成,用冷冻切片时显示结核杆菌时,可以在室温下进行,用石蜡切片显示结核杆菌时,可以在室温下,也可以在恒温干燥箱中进行。
(2)、 浸染切片的时间。由于结核杆菌菌体含有一层蜡质,如果浸染时间不足,染液是很难进入到菌体之中去的,为了能使浸染切片有充足的浸染时间,使结核杆菌有一个相对稳定的染色环境,可以提倡浸染一个中午。(大约为3小时)。
(3)、切片的分化。切片的分化是整个染色过程的最关键步骤,分化不足,红色将覆盖整个切片,菌体将无法分辨,分化过度,菌体将无法见到或难以见到,分化要做到刚刚合适,才能将杆菌给予显示出来。我们采用四级分化法,即先用浓度较高的硫酸水溶液,然后逐步降低浓度,
(4)、切片选用的对比染色液。对比染色液的选用,也不能马虎,常规使用的一般都是用明矾苏木素染液染细胞核,它能使细菌的定位较好,细菌是位于细胞核、细胞间还是间质里,随着细胞核的染色,都能较好的完成,但这种常用的对比染色,发现寻找细菌比较困难,对于含量很少的细菌,往往需要花去很多的时,才能完成观察。如果采用淡绿醋酸染色液作对比染色,情况就大不一样。淡绿和 红色是两种对比色调非常鲜明的颜色,如果操作得当,被染为红色的结核杆菌,就如同一片绿洲中的红花,一目了然。寻找观察切片就不需要花去很多的时间。应用淡绿的浓度应合适,浓度过高如0.5%、1%,这种浓度会遮盖已被染上颜色的细菌,使其不能很好的显示出来,合适的浓度是0.1%-0.2%。
(5)、 附贴切片必须选用硅化载玻片。切片的往后处理,除了有的需要加热外,还必须用各种不同浓度的硫酸水溶液处理,因此切片必须附贴牢固,才能经得起各种考验,否则将会前功尽弃。
(6)、原法使用二甲苯脱蜡和各级酒精洗。这对杆菌的保存不好,本改良法先用汽油-松节油脱蜡,再用二甲苯快速洗去汽油-松节油的残液,既可保护好杆菌菌壁的各种物质,又可使切片保持清洁。
(7)、原法中在切片染色完成后,用酒精脱水,改良法省去这一步骤,这是因为抗酸杆菌虽然不怕酸的作用,但就怕酒精,酒精能把已着染的红色脱去干净。因此改良法在完成染色后,让其自然风干,再经二甲苯的透明,继用中性树胶封固,就可以了。如此处理切片可以保存很长时间。

五、抗酸染色的临床应用。
1、可对炎性肉芽肿进行鉴别和诊断。炎性肉芽肿分为感染性肉芽肿和异物性肉芽。而感染性肉芽肿常常是由各种致病菌引起的,如结核杆菌引起的结核性肉芽肿,麻风杆菌引起的麻风肉芽肿等,在这些组织中应用特殊染色找出病原菌,就可确诊为阳性菌的病种。如浆细胞肉芽肿与分支杆菌性假瘤的表现十分相似,但后者常见于免疫抑制的病人,病变中含有许多抗酸染色阳性的杆菌。[ 2,1040]因此用抗酸染色可以将两种疾病进行鉴别。
2、可用于着色真菌的鉴别。着色真菌病中的皮肤型,表皮不规则增生,甚至为假上皮瘤状,真皮内有广泛肉芽肿浸润,其中可见许多朗罕型或异物型巨细胞及含有大量嗜中性细胞小脓肿,也可见结核样结节,但无干酪样坏死[5,52 ] 。此组织学看起来好像是结核样的组织像,但只要用用特殊染色法,不管是抗酸染色也好,还是六胺银染色液好,只要将致病菌给予显示出来,就能做出正确的诊断。
3、可用于对各类型麻风病的鉴别。至今为止,国内将麻风病分为五种类型他们是:第一种结核样型麻风,组织学表现为出现上皮样细胞而形成结核样肉芽肿,真皮内表皮下可见到结核样浸润。血管和皮肤附件周围神经内外均可见类似浸润,上皮细胞分化良好,郎罕氏巨细胞可有可无,上皮样细胞浸润周围有密集的淋巴细胞,抗酸杆菌染色呈阴性。 第二种是:偏结核样型界线类麻风。该型的组织学与第一种有些相似,特别是真皮内肉芽肿浸润的细胞成分极为相似早期的抗酸染色呈阴性。随着病情的发展,至晚期抗酸染色显示阳性。第三种 :中间界线类麻风。该病的组织学表现为在真皮内有肉芽肿浸润,其浸润方式有二,一是以组织细胞为主,周围没有淋巴细胞,浸润内可见分化好的细胞;另一是以结核浸润和泡沫细胞。抗酸染色可见到较多的麻风杆菌。第四种:偏瘤型界线类麻风。该病的组织学表现为表皮萎缩,真皮内肉芽肿浸润主要为组织细胞,在肉芽肿内含有大量的麻风杆菌。抗酸染色麻风杆菌显示成团出现,真皮内肉芽肿浸润的地方随处可见。第五种:瘤型麻风。该病的组织学表现为早期可见浅表性浸润,真皮网状层血管,皮肤附件和神经小分支周围出现肉芽肿性浸润,随着病情的不断发展,直至最后组织细胞内吞噬着大量的成团的成堆的麻风杆菌,习惯称之为麻风球[5,41-45 ]。抗酸染色,这一类型的麻风杆菌最为突出,最为典型。
上述五种类型的麻风病,他们在不同的时期都有不同的表现,组织学形态也有不同的表达,抗酸染色,有的被染为强阳性,有的是中度阳性,有的是弱阳性,有的则为阴性。根据抗酸菌的强弱表达,麻风杆菌的多寡,就可判断和鉴别属于哪种类型的麻疯病,这就是特殊染色才能完成的特殊功效。
4、可用于免疫缺陷病人的肺活检的辅助检查。在免疫缺陷病人的肺活检中,其肺泡内和肺实质中可见到大量的泡沫样组织细胞浸润,周边及间质有蛋白性物渗出,见到如此现象者,应用抗酸染色法,在上述的组织中,可见有大量的抗酸菌位于细胞浆内,此为鸟形分枝杆菌。[3 ] 该菌细条状,断面细颗粒状,在吞噬细胞或组织细胞内。应与结核杆菌相区别,在艾滋病人群中,由于其自身免疫功能下降容易感染多种病菌如卡氏肺囊虫、霉菌和分枝杆菌。结核杆菌较为多见,应与前者区别。
5、获得性免疫缺陷综合征相关合并症淋巴结继发结合感染。Fite 染色在破坏的淋巴结中可见大量抗酸杆菌,淋巴细胞消减,巨噬细胞增生。获得性免疫缺陷综合征相关合并症淋巴结,继发隐球感染,高倍可见典型星型隐球菌,淋巴结表现为淋巴细胞消减,尽管有大量的隐球菌存在,却无肉芽肿反应。[ 2 ,721]
6、可用于Whipple病和鸟形分枝杆菌-细胞内复合体(MAIC)的鉴别。在Whipple病和MAIC的巨噬细胞中均可出现包含体,但只是形状不同。在Whipple病包涵体是明亮染色的粗颗粒状;在MAIC PAS染色揭示浅染阳性的杆菌形状。应用抗酸染色可将两者鉴别开来,MAIC抗酸染色阳性,而Whipple病则是阴性。[ 2,1357]

参考文献:
1、沈英甲。 抗药性肺结核为何增多?科技日报;第四版:2006-11-24
2、主编Stephen S。Sternberg。主译回允中。诊断外科病理学。第三版,北京;北京大学医学出版社,2003; 25
3、原著[美]Juan Rosai 回允中主译,阿克曼外科病理学。第八版下卷,沈阳辽宁教育出版社,1999
4、Bancroft JD. Theory and Practical of Histological Techniques. Churchill Livingstone,Edinburgh London Melbourne and New York,1977;
5 、王光起主编。皮肤组织病理彩色图谱。北京人民卫生出版社。1982;41-45
 

 

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