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HER2基因检测 在乳腺癌中的应用
 


更新时间:2008-04-02 09:26:26 作者: 广东省人民医院病理医学部病理科 刘艳辉


HER2基因
^HER2,又名HER2/neu,c-erbB-2,表皮生长因子受体(EGFR)家族成员;
^原癌基因,位于17q21,编码相对分子质量185KD的跨膜糖蛋白(跨膜酪氨酸激酶受体);
^研究表明:30%以上的人类肿瘤中存在HER2基因的扩增/过度表达(如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等);其中20%-30%的原发性浸润性乳腺癌有HER2基因的扩增/过度表达。

HER2癌基因的致瘤机制
^抑制凋亡,促进增殖;
^增加肿瘤细胞的侵袭力;
^促进肿瘤血管新生和淋巴管新生。

乳腺癌中HER2基因扩增/过度表达的临床意义
^无病生存期和总生存期短相关,肿瘤预后差。在多变量分析结果中,HER2是肿瘤复发和总生存期长短的独立预后因素。
.HER2是目前公认的一个乳腺癌重要的预后/预测因子。
.2005年St. Gallen国际治疗指南中HER2基因扩增/过度表达与乳腺癌危险度分级(低,中,高)相关。

2005年St. Gallen国际治疗指南 乳腺癌危险度分级

              低度                中度                   高度
淋巴结        -                 -1                   
+(1~3)1
                                 +(1~3)2              
+(﹥ 3)2
pT(cm)     
≤2                伴﹥21
病理分级       1                或 2 ~ 31
瘤周脉管      -                或 +1
HER2          -               
或 +1                      +1
                                 
-2
年龄           ≥35             或<351

HER2阳性状态的患者无病生存期亦缩短
淋巴结阳性                              淋巴结阴性


HER2阳性患者的生存期比阴性者缩短一半以上
转移性乳腺癌患者的中位生存期
HER2 阳性 8-10个月HER2 阴性 17-22个月
Slamon DJ et al. Science 1987;235:177–82

^HER2阳性状态可以预示肿瘤对常规治疗的反应情况。
.内分泌治疗
      HER2阳性患者相对耐药
.CMF方案    
    HER2阳性患者相对耐药
.蒽环类    
     对大剂量相对敏感
.紫杉类药物 
    相对敏感

靶向HER2人源化单抗 -曲妥珠单抗(赫赛汀)
^复发转移乳腺癌
.单药应用:有效率15%-30%
.联合紫杉醇(国内,31例,有效率 25.8%)
.联合其他化疗药物
.联合内分泌治疗
.联合其他靶向性药物
^早期乳腺癌
.辅助化疗(国际多中心临床研究,术后,入组13000例,复发风险↓39%-52%)
.新辅助化疗

HER2扩增和过度表达


HER2的检测方法
免疫组织化学(IHC):HER2蛋白的表达
荧光原位杂交(FISH): HER2基因的扩增
显色原位杂交(CISH) : HER2基因的扩增
酶联免疫分析(EIA)
酶联免疫吸附分析(ELISA)
聚合酶链反应(PCR)

IHC
检测HER2表达初筛最常使用的方法。
判断HER2蛋白过表达最重要的是染色方法的标准化和结果的判断。
建议使用美国食品和药品管理局(FDA)批准的试剂盒。
应使用EnVision法和高质量的DAB显色液以避免内源性生物素的影响。
应有严格的、包括内部和外部的质量控制,须设阳性对照、阴性对照和空白对照。

免疫组织化学法原理 Immunohistochemistry (IHC)

   一抗结合于Her-2受体           二抗结合并激活底物反应显色

常用IHC 检测的抗体/试剂盒
抗体/试剂盒     类型     公司名
CB11            单抗        Novacastra (newcastle, upon tyne, UK)
4D5             单抗        Genentech(San Francisco, CA)
TAB 250         单抗        Zymed ( San Francisco, CA)
A0485           多抗        DAKO( San Francisco, CA)
HercepTestTM    多抗        DAKO ( San Francisco, CA)
HercepTest: 美国FDA批准用于临床诊断

IHC结果判断
先在10×物镜下进行判读
注意细胞膜完全着色的癌细胞比例及着色强度
胞质着色应忽略不计
导管内癌(DCIS)的着色应忽略不计,只评定浸润癌的着色情况
正常乳腺上皮不应着色
应使用美国FDA批准的HercepTest评分系统





免疫组织化学法Immunohistochemistry (IHC)
优点: - IHC 是每个实验室都具备条件的检测
- 相对价格低廉,容易操作
- 不需要特殊的设备要求

缺点: - 2+ 和 3+没有一个绝对的判读标准
- 有一些自备试剂无统一标准
- 与抗原降解的数量有关
- 与抗原的修复程度有关

FISH
是一种分子细胞遗传学技术,通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交。在荧光显微镜下,于细胞和(或)组织原位观察并分析细胞核内杂交于DNA靶序列的多种彩色探针信号,以获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种基因状态的信息。
“金标准”

荧光原位杂交法原理 Fluorescence in situ Hybridisation (FISH)


HER2探针
绝大部分是同时含有HER2基因(标记为橘红色荧光)和该基因所在的17号染色体着丝粒(标记为绿色荧光)序列的混合探针
应使用美国FDA已经批准的探针

几种可检测HER2 的FISH商业试剂盒

Abbott
PathVysionTM 应用Her-2和17号染色体双荧光标记探针. 两者信号的比值决定Her-2是否扩增

Ventana
INFORM® 应用单一针对her-2的地高辛标记探针. 直接定量Her-2的扩增程度

DakoCytomation
HER2FISH PharmDxTM应用双标记探针,与pathVysion 相似

Pathvysion 和INFORM为美国FDA批准用于临床诊断

质量控制
内对照:杂交的组织、细胞中有75%的细胞核显示出双色信号时,视为实验成功,并且红、绿信号互为对照,癌与非癌细胞互为对照。
外对照:应选择FISH阳性和阴性的标本片。

观察程序
HE染色切片上确认癌细胞区域,在10x物镜下,于FISH标本上找到与HE染色切片上相同的组织细胞结构,仔细观察信号。
在40x物镜下扫描整张切片,观察是否存在HER2表达的异质性,以及标本的质量,满意的标本应是75%以上癌细胞核中都有杂交信号。
于100x物镜下,通过特异的单通道滤光片观察癌细胞核的FISH结果并进行信号计数和比值计算。

结果判读
杂交信号计数
应选择细胞核大小一致、核的边界完整、二脒基苯基吲哚(DAPI)染色均一、细胞核孤立无重叠、绿色着丝粒信号清晰的细胞。
随机计数20~30个癌细胞核中的双色信号。
判读标准
红色信号的总数与绿色信号的总数比值≥2时,即为HER2基因扩增
若红、绿两信号的比值>20或众多信号连接成簇时可不计算,即视为基因扩增;
若比值介于1.8~2.2之间,则需要再计数20个细胞核中的信号或由另外一个分析者重新计数。如仍为临界值,则应在FISH检测报告中注明。
若HER2基因扩增在不同癌细胞中存在异质性时,应在另一癌区域再计算20~30个癌细胞核中的红、绿信号值,报告其最大值,并加以注释。
注意避免G2期细胞内的基因拷贝数目特征(4个拷贝)可能导致的计数误差。

评价17号染色体数目和意义
HER2基因位于17号染色体上,大约有47%的乳腺癌存在17号染色体非整体性,即17号染色体不是正常的二体,而是单体或多体。
绿色探针可以将17号染色体的非整体性和单纯的HER2基因扩增,尤其是低水平的扩增区分开。
当HER2基因与17号染色体数目比值大于2时,即为HER2基因扩增。
加入了这个内对照,就排除了单色探针(探针中仅有HER2基因)可能造成的假阴性(17号染色体单体)或假阳性(17号染色体多体)。
临床研究显示,具有这类遗传学特征的患者对治疗的反应和预后与单纯的基因扩增明显不同。


FISH: PathVysionTM
                 无扩增                                        扩增

        比值 < 2 提示Her-2无扩增                       比值 > 2 提示Her-2有扩增

FISH: INFORM®

                   低扩增                                        高扩增

FISH与IHC比较
                  IHC
                   0-1             2               3
FISH阳性率        4 - 9%        24-50%          85-100%
Fornier M,et al. Oncology, 2002,16:1340

IHC 3+ 与 FISH阳性病人的临床有效率相似


荧光原位杂交法(FISH)的优缺点
PathVysion
优点: - 非常准确, 重复性好
- 与临床疗效相关性好
- 冰冻和固定的标本均可
- 很少量的标本亦能检测

缺点: - 需要置备荧光显微镜等设备
- 操作者需非常有经验
- 不能检测出细胞表面过度表达但基因
不扩增的标本

基因扩增的判读标准

具备17号染色体对照的系统l:                        没有染色体对照的系统:

基因扩增信号数除以17号染色体数                     基于HER2基因扩增的信号
正常 = 1.0 ;                                         扩增= >4-5
扩赠 = >2.0
调整范围 = 1.8 - 2.2

CISH
使用地高辛标记的探针,在甲醛固定、石蜡包埋组织的切片上进行杂交反应,再用鼠抗地高辛-抗体和辣根过氧化物酶-抗鼠抗体进行免疫结合,DAB显色后,用普通显微镜亮视野下观察HER-2基因信号。
相关研究显示,乳腺癌中CISH与FISH检测结果的符合率达90%以上

色素原位杂交法原理 chromogenic in situ hybridization (CISH)

Denature target DNA and hybridise probe
Primary antibodybinds to the probe
Secondary antibody (with unactivated visualisation agent) binds to primary antibody

影响检测结果的因素
技术方面:加热预处理的温度和时间;消化时间的长短;加热共变性时杂交液的蒸发;杂交后洗涤是否干净;苏木精对比染色的深浅。
注意事项:加热预处理的温度保证在98oC以上,最好完全煮沸,时间15min;具体消化时间因组织的固定时间、固定方式、切片的厚度而异,建议消化时间5~30min;杂交液滴加后,必须覆盖杂交膜,再用封片胶密封;杂交后洗涤温度最低应在75oC以上,最高不超过80oC;苏木精对比染色不可过深,否则会遮盖杂交信号。
最关键的、最困难的是消化时间的掌握,消化不足会影响杂交效果,消化过度会破坏组织形态。

质量控制
检测人员须经过CISH专门培训。
每次染色必须设立严格的阴性、阳性对照,被测切片中癌旁正常乳腺组织、间质细胞、淋巴细胞均可作为阴性对照。
镜下观察条件:普通显微镜亮视野下40x物镜观察。

结果判断标准
无扩增:大于50%的肿瘤细胞每个核内有1~5个信号点;
低拷贝扩增:大于50%的肿瘤细胞核内有6~10个信号点;
高拷贝扩增:大于50%的肿瘤细胞核内有多于10个信号点或者凝结成团块状、簇状信号颗粒;
对于杂交信号在5~6个、难以判断的标本,应经FISH重新检测。



CISH检测无HER2基因扩增样本

A diploid-triploid HER2 copy number is usually clear

CISH检测低扩增样本

CISH检测高拷贝扩增样本

HER2 CISH Aneuploidy

Aneuploidy (3 to 5 signals per nucleus) is very common in breast carcinoma. This is NOT gene amplification.

CISH与IHC比较
              IHC
             0     1      2      3
CISH阳性率  0-10% 0-38% 31-50% 91-100%
Saez A,et al. Breast, 2006,15:519
Peiro G,et al. Mod Pathol, 2004, 17:277

显色原位杂交法(CISH)的优缺点
优点: (1) 色素显色可在普通显微镜下观察
(2)染色结果保持时间长
(3)与FISH结果有很好的一致性
(4)检测成本低
芬兰用CISH检测HER2基因扩增代替了FISH,在
芬兰已作为常规检测
缺点: 病例积累尚少, 在用CISH替代FISH常规
检测Her-2基因扩增前仍需进行大量研究


IHC
成熟的技术
快速同时得到许多病例结果
读片较为简单

CISH
操作和判读方法与IHC相似
同时可以进行组织学评估
与FISH检测结果相关性高

FISH
准确、重复性好与疗效相关性好
需置备荧光显微镜等设备
操作者需非常有经验

检测时机
手术前穿刺活检或手术切除的肿瘤经病理明确诊断为乳腺癌时即可检测HER2蛋白和基因状态。
复发和转移病例应再对复发、转移癌进行检测。

实验室要求
HER2蛋白和基因扩增的检测均应在有相关资质的病理实验室进行;
必须严格按照《指南》要求的程序操作,以保证结果可靠;
HER2基因扩增的检测须应用FISH或CISH。

组织标本的制备
标本的类型:新鲜(冷冻)标本;针吸活检标本;粗针穿刺标本;外科手术标本。
标本的固定:从取材到固定的时间不超过1h。固定时间以6~48h为宜。不宜用微波快速固定组织。
固定液的类型:4%中性(磷酸缓冲)甲醛固定液。
标本的取材:取材厚度应<5mm。
组织切片:未染色的切片置于室温不宜超过4~6周,以防抗原丢失;用于IHC染色者以3~5μm为宜,FISH和CISH法以4~5 μm为宜,空气中略微干燥后应立即烤片(IHC:70oC,45~70min;FISH:63oC过夜);完成检测的切片,IHC和CISH可按常规长期保存,FISH应保存于-20oC,一般为1~2年;三种方法均有HE染色切片作为对照。

HER2测定流程图

 

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