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FISH技术在实体肿瘤基因检测中的应用
 


更新时间:2008-11-08 10:15:01 作者: 中山大学中山医学院病理学教研室 附属第一医院病理科 李智


 

概 述

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)是在原有的放射性原位杂交技术基础上发展起来分子细胞遗传学技术

应用于基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学研究等

其基本原理是通过标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交,获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种基因状态的信息

用已知的荧光素标记单链核酸为探针,按照碱基互补的原则,与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合,形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列,因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位

采用生物素标记DNA探针,杂交后用藕联有荧光素亲和素进行检测,同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物,进一步将荧光信号放大,从而可以使检测的灵敏度提高

常用检测方法在实体肿瘤应用的比较

检测方法 检测指标 优点 缺点
IHC 蛋白质 费用低
光镜即可观察结果
准确性差,主观性强,假阳性率高
CISH DNA 光镜即可观察结果 对低度扩增及染色体非整倍扩增检测灵敏度下降
FISH DNA 对于低倍、高倍染色体非整倍性扩增检测准确性高,灵敏度特异性好,结果判断客观 相对费用较高
 

FISH与其它染色体检测技术在实体肿瘤应用的比较

方法 检测指标 技术特点
FISH DNA 用于间期细胞样品,荧光显直接观察荧光信号,直观计数染色体靶位点拷贝数
染色体显带分析 DNA 用于中期分裂像细胞
定量PCR DNA 假阴性和假阳性比例较高,对同一样本只能作一次分析,不能重复实验结果; 制定标准曲线后方可进行基因拷贝数预测

FISH在实体肿瘤应用的目的
个体化治疗方案确定
肿瘤诊断
预后判断

乳腺癌HER-2基因扩增检测


致癌基因:Her-2基因
位点:17q11.2-q12
编码蛋白:跨膜蛋白(与表皮生长因子受体部分同源)
25-30%乳腺癌病人都有HER-2的扩增
HER-2基因扩增是决定Herceptin是否有效的关键性指标

检测探针: GLP Her2 / CSP17
GLP(位点特异性探针)
CSP(染色体着丝粒探针)
探针定位: Her2:17q11.2-q12
CSP17: 17p11.1-q11.1
标记颜色: Her2 (Red)
CSP17 (Green)
正常: 2R/2G
异常: 红信号≥2为异常细胞(绿色信号不少于2个的细胞)

统计Ratio值(计数浸润性部分的20个细胞)
Ratio值=20个细胞核中红信号总数/绿信号总数
Ratio<1.8 为阴性结果
Ratio>2.2或众多信号连接成簇时可不计算为阳性结果
比值2~4为低度扩增; 4~10为中度扩增; >10为高度扩增
Ratio在1.8-2.2 之间时,则需要再计数20个细胞核中的信号,或由另一分析者重新计数。如仍为临界值,则应在FISH检测报告中注明。
若基因扩增在不同癌细胞中存在差异时,应在另一癌区域再计算20个癌细胞信号比值,报告其最大值,同时加以注释
 


其他可经FISH检测确定的实体肿瘤治疗方案

临床治疗 作用靶点 肿瘤种类
Gleevec(格列卫) Bcr-Abl,C-Kit酪氨酸激酶 慢性髓细胞性白血病、胃肠间质瘤
Tarceva(塔西法) EGFR 化疗耐药的非小细胞性肺癌
Iressa(易瑞沙) EGFR 晚期或转移性非小细胞肺癌
Avastin(阿瓦斯丁) VEGF 转移性结直肠癌、乳腺癌
Erbitux(艾比特恩) EGFR EGFR阳性的转移性结直肠癌;肾癌、胰腺癌、头颈部肿瘤也有效

FISH在实体肿瘤应用中的诊断意义
宫颈细胞由不典型增生向宫颈癌转变过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增,其中涉及到的最重要的基因可能是人类染色体末端酶(hTERC)基因
3号染色体长臂扩增能区分CINI与CIN II-III,特异性90%以上
同时这一区段扩增提示有恶变可能,有助于宫颈癌早期诊断和风险预测
检测探针:GLP TERC (Red)3q26.3
CSP 3 (Green)3p11.1-q11.1

膀胱癌遗传学改变中9号染色体部分或全部丢失是最常见的遗传学特征之一,这一异常,特别是p16基因缺失与膀胱癌的早期发生密切相关
膀胱癌的发展与染色体不稳定性如3号、7号和17号染色体的非整倍性也有关联。
四个指标中一个异常,高度疑为癌;如同时有两个或两个以上指标异常,可确诊为癌
可用组织学样本,也可用尿液样本
检测探针:GLPp16(Red)9p21/CSP17(Green)17p11.1-q11.1
CSP7(Red)7p11.1-q11.1/CSP3(Green)3p11.1-q11.1

滑膜肉瘤形态多样,发病部位广泛,免疫组化染色缺乏特异性抗体,造成诊断困难
遗传学特征为90%以上滑膜肉瘤存在特异性t(x:18) (p11.2; q11.2),导致18号染色体SYT基因易位和X染色体的SSX基因产生SYT-SSX融合基因
检测探针:SYT(Red)18q11.2/SSX(Green)Xp11.2

FISH在实体肿瘤应用中的预后判断

特异性基因改变 相关肿瘤 预后评估
P53基因缺失(17p13.1) 多种人类种瘤 预后最差
C-myc基因扩增(8q24) 乳腺癌、结肠癌、胃癌、头颈部鳞癌 进展快
GL1基因扩增(12q13) 胶质瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、畸胎瘤 预后不良
7号染色体或7q缺失 髓细胞性白血病 预后不良
N-myc基因扩增 神经母细胞瘤 预后不良

制片
(1)为降低背景影响,在清洗玻片后,浸泡于70%乙醇中,以消除玻片中自发荧光物质

预处理
(1)预处理溶液温度是作用的关键,应将预处理液提前于80度水浴中预热30分钟以上
(2)蛋白酶处理时间是实验成功与否的关键,视切片本身情况可37度处理10-30分钟,对于初次检测的样本,可先在蛋白酶处理后直接DAPI复染后观察细胞形态和周围粘附物情况而判断蛋白酶处理时间是否合适,避免造成探针的浪费

杂交
(1)变性液离子浓度是影响实验结果的另一关键因素,务必使用去离子甲酰胺,并调节pH值,否则信号变弱或无信号
(2)由于玻片温度远低于变性液温度,每增加一张玻片,就性液降温约0.25度,故一次变性玻片不应超过4张
(3)盖玻片时尽量轻放,以避免气泡;若出现气泡,在封胶前务必赶除气泡,避免因杂交区域不均影响结果

复染观察
(1)DAPI复染后,为优化图像观察结果,可先暗处-20度保存30分钟
 

 

 

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